El estrógeno refuerza la integridad de los vasos sanguíneos en el hueso durante el embarazo y la menopausia

Nature Cardiovascular Research volumen 1, páginas 918–932 (2022)Citar este artículo

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El sistema esquelético de los mamíferos muestra diferencias sexuales en estructura, funciones, envejecimiento e incidencia de enfermedades. El papel de los vasos sanguíneos en las funciones óseas fisiológicas, regenerativas y patológicas indica el requisito para comprender su especificidad sexual. En este estudio, encontramos que el estrógeno regula la fisiología de los vasos sanguíneos durante el embarazo y la menopausia a través del receptor de estrógeno alfa (ERα) y el receptor de estrógeno 1 acoplado a proteína G (GPER1), pero no la señalización dependiente de ERβ en ratones. El estrógeno regula el uso de lípidos de las células endoteliales óseas (BEC) y promueve la lipólisis de los adipocitos y la absorción de ácidos grasos (FA) del microambiente. Las condiciones bajas de estrógeno sesgan el metabolismo de los ácidos grasos endoteliales para acumular peróxidos de lípidos (LPO), lo que lleva al envejecimiento vascular. Los altos niveles de iones ferrosos en los BEC femeninos intensifican la acumulación de LPO y aceleran el proceso de envejecimiento. En particular, la inhibición de la generación de LPO con liproxstatina-1 en ratones de edad avanzada mejoró significativamente la salud ósea. Por lo tanto, nuestros hallazgos demuestran los efectos del estrógeno en los BEC y sugieren que la orientación de LPO podría ser una estrategia eficiente para controlar la salud de la sangre y los huesos en las mujeres.

Los cambios en el sistema esquelético durante la pubertad, el embarazo y la menopausia están controlados por hormonas sexuales que directa o indirectamente regulan la remodelación ósea fisiológica y patológica1,2. El papel de las hormonas sexuales sobre las células mesenquimales y las células hematopoyéticas ha sido bien reconocido3,4. A pesar de desempeñar un papel central en la fisiología esquelética al regular el desarrollo, la reparación, el envejecimiento y la enfermedad5,6,7, la medida en que las funciones de los vasos sanguíneos difieren entre sexos sigue sin comprenderse bien. En este estudio, investigamos los cambios en los vasos sanguíneos durante el embarazo y la menopausia, así como el papel de las hormonas esteroides en la mediación del crecimiento y el envejecimiento de las BEC.

Para comprender los cambios celulares en el microambiente óseo materno (BM) durante el embarazo, analizamos la tibia de ratones preñados en diferentes días posteriores al coito (dpc) utilizando métodos de imagen mejorados8. Usamos endomucina (Emcn) y CD31 para marcar los vasos sanguíneos, osterix para marcar las células del linaje osteoblástico temprano (OBL) y perilipina para identificar los adipocitos en la MO. Los capilares tipo H que expresan CD31 alto/Emcn alto son vasos sanguíneos angiogénicos que apoyan la osteogénesis en el hueso9,10. Observamos un aumento notable en los vasos tipo H y las células OBL y una disminución en los adipocitos en los huesos de las presas preñadas de 10.5 dpc en comparación con las vírgenes de camada, los machos y otras etapas preñadas (Fig. 1a y Datos extendidos Fig. 1a, b). El aumento del porcentaje de células endoteliales (EC) CD31+CD45−Ter119− totales, EC CD31 alto/Emcnhigh (tipo H) dentro de las EC totales y EC proliferantes (Ki-67+) confirmó la promoción de la angiogénesis en 10.5 dpc (Fig. 1b, Datos extendidos Fig. 1c y Fig. 1 complementaria).

a, Imágenes confocales representativas de los cambios en los vasos de tipo H (Emcnhigh/CD31high) en los huesos maternos en diferentes momentos del embarazo del ratón y después del parto. Los puntos de tiempo del embarazo se representan en días posteriores al coito (dpc) y los días posteriores al parto como días posteriores al parto (dpp). Barras de escala, 40 μm. b, Cuantificación de vasos tipo H descritos en a, como área de CE tipo H normalizada al área de metáfisis (mp) (n = 5); las EC totales (CD31+CD45−Ter119−) y las EC tipo H (CD31high/Emcnhigh) se caracterizan por citometría de flujo (n = 5). Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes y la media ± sem para los datos de citometría de flujo; ANOVA unidireccional con prueba de Tukey. c, Imágenes confocales representativas de vehículos y VCD (n = 5) ratones modelo (20 semanas de edad) que muestran vasos de tipo H reducidos en el modelo VCD. Barras de escala, 40 μm. Los gráficos indican el área de las EC de tipo H normalizadas al área de mp y las EC totales cuantificadas por citometría de flujo. Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes y la media ± sem para los datos de citometría de flujo; Prueba t de dos colas para datos no apareados. d, imágenes confocales representativas que muestran cambios en los vasos tipo H en ratones machos y hembras (P28) tras tratamientos hormonales con cuantificación de CE tipo H y cuantificación del área (n = 5); citometría de flujo (vehículo n = 5 F, n = 7 M; E2 n = 8 F, n = 7 M; P4 n = 5 F, n = 5 M; DHT n = 5 F, n = 5 M). Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes y la media ± sem para los datos de citometría de flujo; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. Barras de escala, 40 μm. F, hembra; M, macho.

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Para comprender los cambios celulares en las evacuaciones intestinales durante la menopausia, generamos un modelo de ratón de menopausia mediante la inyección de diepóxido de vinilciclohexeno (VCD) en hembras de 12 semanas de edad. La inyección de VCD durante 20 días y el análisis después de 32 días confirmaron el agotamiento completo de los folículos ováricos (Fig. 2 complementaria), que modeló las condiciones de la menopausia humana11,12. Los huesos de ratones menopáusicos mostraron una disminución de BEC totales y de tipo H (Fig. 1c), además de células OBL reducidas y aumento de adipocitos (Datos extendidos, Fig. 1d). Estos hallazgos muestran que el embarazo y la menopausia desencadenaron cambios significativos en los compartimentos endoteliales y mesenquimales dentro de la MO.

Para comprender la contribución de las hormonas sexuales en estos cambios celulares, administramos las hormonas sexuales estradiol (E2; 17β-estradiol, 2 µg por día), progesterona (P4; 1 µg por día) y dihidrotestosterona (DHT; 100 µg por día) a ratones machos y hembras jóvenes durante 10 días y analizó sus BM después de 2 semanas. El tratamiento sistémico con E2 dio como resultado la acumulación de capilares de tipo H en el compartimento de la médula ósea. Observamos una mayor frecuencia de EC totales y tipo H en huesos de ambos sexos en comparación con los huesos administrados con P4 y DHT (Fig. 1d y Datos extendidos Fig. 1e). El aumento de las células OBL y la disminución de los adipocitos de los huesos tratados con E2 indicaron que los cambios celulares eran similares a los cambios asociados con el embarazo. Aunque las células OBL mostraron un aumento marginal en el tratamiento con DHT, los adipocitos no se alteraron en los tratamientos con P4 y DHT (Datos extendidos, Fig. 2a). Además de los capilares tipo H, E2 promovió vasos arteriolares (vasos CD31+Emcn−) y transcorticales (TCV) en huesos tratados con E2. Los subtipos capilares no se modificaron en los tratamientos con P4 y DHT (datos extendidos, Fig. 2b). El análisis de la proliferación de EC mediante el marcaje con 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y la inmunotinción con Ki-67 mostró una mayor incorporación de EdU y una mayor frecuencia de EC con Ki-67+ en los huesos tratados con E2. Del mismo modo, los BEC primarios cultivados mostraron una mayor proliferación in vitro con el tratamiento con E2 (10 μM) (Datos extendidos Fig. 2c, d). También analizamos los niveles de transcripción de factores angiogénicos en BEC purificados para comprender la angiogénesis. La expresión más alta de reguladores angiogénicos conocidos en BEC tratados con E2 en comparación con los controles del vehículo apoyó la promoción de la angiogénesis en los huesos mediante niveles elevados de E2 (Datos extendidos Fig. 2e). La cuantificación de los niveles de E2 en diferentes etapas del embarazo (Datos ampliados, Fig. 3a) confirmó niveles elevados de estrógenos endógenos en madres preñadas de 10,5 dpc correspondientes al estado de angiogénesis en sus huesos. De manera similar, el envejecimiento redujo los niveles de E2 circulantes en ratones (Datos extendidos, Fig. 3b). Para estudiar los cambios en los vasos sanguíneos de los huesos en condiciones sistémicas bajas de E2, utilizamos modelos de ratones ovariectomizados (OVX). La ovariectomía ha sido un método establecido para reducir los niveles circulantes de E2 y promover la pérdida ósea13. La ovariectomía se realizó en ratones hembra de 8 semanas de edad y los huesos se analizaron después de 6 semanas. Los ratones OVX demostraron fenotipos vasculares y mesenquimales similares al agotamiento del folículo ovárico. La recuperación de fenotipos óseos en ratones OVX tras la administración de E2 estableció el papel central del estrógeno en este fenotipo (Datos ampliados, Fig. 3c). También usamos el inhibidor farmacológico de la aromatasa letrozol para detener la síntesis de estrógenos y, por lo tanto, reducir los niveles de E2 circulantes. La administración de letrozol (100 µg por día) en ratones redujo los capilares angiogénicos de tipo H y las células OBL y aumentó los adipocitos en los huesos en desarrollo (Datos ampliados, Fig. 3d). Estos hallazgos establecieron el papel del estrógeno en la regulación del crecimiento de los vasos sanguíneos en el hueso.

Para estudiar los cambios específicos del endotelio mediados por el estrógeno, investigamos la señalización de ER en BEC. El análisis de transcripción para ER en BEC recién aislados mostró expresión de Esr1 (ERα), Esr2 (ERβ) y Gper1 (GPER1) en ambos sexos (Datos extendidos Fig. 4a). Investigamos las funciones de los ER en el crecimiento de los vasos sanguíneos dirigiéndonos a receptores individuales en BEC. Generamos ratones inducibles con pérdida de función específica de EC utilizando los alelos Esr1 (Esr1lox/lox)14, Esr2 (Esr2lox/lox)15 o Gper1(Gper1lox/lox)16 flanqueados por loxP con la línea de ratón Cdh5(PAC)-CreERT217. Analizamos huesos masculinos y femeninos posnatales (4 semanas de edad) para comprender los cambios en los vasos sanguíneos. Las eliminaciones de genes se confirmaron mediante la cuantificación de los niveles de transcripción del receptor en BEC purificados de ratones de control y mutantes (Datos extendidos, Fig. 4b). La eliminación de un receptor mostró una influencia mínima en los niveles de transcripción de los otros receptores en BEC (datos extendidos, Fig. 4b). La pérdida de funciones específicas de EC de Esr1 y Gper1 resultó en la reducción de EC totales y de tipo H, mientras que los mutantes de Esr2 no manifestaron fenotipo endotelial en ambos sexos (Fig. 2). Por lo tanto, la inhibición de los ER Esr1 y Gper1 perjudicó el crecimiento de los vasos sanguíneos en los huesos. También observamos una reducción de los números de OBL y un aumento de adipocitos en los mutantes Esr1 y Gper1 (Datos extendidos Fig. 4c). Realizamos un análisis de microtomografía computarizada (micro-CT) de huesos mutantes Esr1 y Gper1 para comprender los cambios a nivel de todo el órgano. Los datos de micro-CT confirmaron la reducción en el hueso trabecular y el aumento en el contenido de lípidos de ambos mutantes endoteliales (Datos extendidos Fig. 5a, b). Un análisis posterior mostró el grosor y el área del hueso cortical inalterados en estos mutantes endoteliales. De manera similar, los osteoclastos en las superficies óseas no se vieron alterados por la eliminación de los ER en las EC. Los osteoclastos asociados a vasos, un subtipo de osteoclastos presentes en la interfaz osteocondral, dependen de los vasos sanguíneos angiogénicos18. La reducción de los osteoclastos 18 asociados a los vasos en la metáfisis apoyó el crecimiento defectuoso de los vasos sanguíneos en estos mutantes (Datos extendidos Fig. 5a, b). Estos hallazgos demostraron el papel funcional de la señalización de ER en BEC y cambios en el BM.

Imágenes confocales representativas de los cambios en los vasos de tipo H (Emcnhigh/CD31high) tras la eliminación específica del endotelio de los ER (Esr1, Esr2 y Gper1) en P28 en ratones. Los gráficos indican cuantificaciones de EC totales (CD31+CD45−Ter119−) por citometría de flujo para Esr1 (control n = 11 F, n = 7 M; mutante n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (control n = 4 F , n = 4 M, mutante n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (control n = 6 F, n = 8 M; mutante n = 6 F, n = 7 M); cuantificación del volumen del vaso tipo H por campo de mp para Esr1 (control n = 11 F, n = 7 M; mutante n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (control n = 4 F, n = 4 M; mutante n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (control n = 6 F, n = 8 M; mutante n = 7 F, n = 10 M); y cuantificación del área EC tipo H normalizada al área mp para Esr1 (control n = 11 F, n = 7 M; mutante n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (control n = 4 F, n = 4 M mutante n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (control n = 6 F, n = 6 M; mutante n = 6 F, n = 9 M). Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes y la media ± sem para los datos de citometría de flujo; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. Barras de escala, 40 μm. F, hembra; M, macho; pf, metáfisis.

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Los cambios mediados por estrógenos en la BM y fenotipos mutantes de ER endoteliales similares en ratones hembra y macho nos intrigaron para investigar las diferencias sexuales en BEC. Realizamos análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) para BEC purificados de ratones machos y hembras de 2, 12 y 65 semanas de edad para comprender sus diferencias sexuales. El análisis de la expresión génica en diferentes etapas de crecimiento y envejecimiento proporcionaría cambios relacionados con la edad en las diferencias sexuales endoteliales. El análisis de componentes principales (PCA) separó las CE masculinas y femeninas en dos grupos, lo que indica la variación entre sexos en todos los grupos de edad (Fig. 3a y Conjunto de datos complementarios 1). Las diferencias de sexo en los transcriptomas BEC aumentaron con la edad, con 48 genes expresados ​​diferencialmente (DE) en ratones de 2 semanas de edad en comparación con 212 y 926 en ratones de 12 y 65 semanas de edad, respectivamente, en un nivel de significación Padj < 0,01 ( Figura 3b). Observamos una superposición sorprendentemente baja en los genes DE entre los grupos de edad, con la superposición más alta de 72 genes detectada entre ratones adultos y envejecidos (Fig. 3c y Datos extendidos Fig. 6a). Para comprender la importancia de los datos de expresión génica, realizamos un enriquecimiento de conjuntos de genes de aplicación general (GAGE) para el análisis de vías para genes DE de datos de 65 semanas19. Un total de cuatro conjuntos de genes mostraron niveles significativos de diferencias con un enriquecimiento notable del conjunto de genes de las vías metabólicas (Fig. 3d). El análisis de los genes DE (Padj <0.05) en este conjunto de genes de vías metabólicas mostró un total de 142 genes alterados entre BEC masculinos y femeninos, con 43 genes asociados con el metabolismo de FA (Datos extendidos Fig. 6b y Conjunto de datos complementario 1). Sin embargo, existe una comprensión limitada del metabolismo de las BEC y su papel en la angiogénesis.

a, Gráficos de PCA de datos de RNA-seq que muestran la agrupación por sexos en BEC de ratones de 2, 12 y 65 semanas de edad (n = 3). b, Los gráficos de volcán muestran el número de genes DE significativos corregidos por FDR (Bonferroni) con valor de P (Padj < 0,01) frente al cambio de log2 veces entre las CE óseas femeninas y masculinas de ratones de 2, 12 y 65 semanas de edad. Los genes DE se obtuvieron ajustando cada gen a un modelo lineal generalizado, seguido de una prueba de hipótesis utilizando la prueba de Wald. c, Diagrama de Venn que muestra la superposición en los genes DE entre las CE óseas de machos y hembras de ratones de 2, 12 y 65 semanas de edad. d, GAGE ​​para el análisis de la ruta de los genes DE en datos de RNA-seq que muestran procesos biológicos que difieren entre los BEC masculinos y femeninos envejecidos. Los conjuntos de datos genéticos de las vías metabólicas, el ciclo celular y el ADN están regulados al alza, y los genes de la vía de la inmunodeficiencia primaria están regulados a la baja. La importancia del enriquecimiento se calculó mediante pruebas t de dos muestras, y los términos KEGG significativos se seleccionaron mediante P < 0,05. e, Gráfico que muestra la cuantificación de BEC cultivadas con Ki-67+ en el medio libre de nutrientes suplementado con glucosa, glutamina o FA, con vehículo (control n = 9, glucosa n = 11, glutamina n = 15, FA n = 12) y tratamiento E2 (control n = 11, glucosa n = 11, glutamina n = 13, FAs n = 12). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. f, Gráfico que muestra la cuantificación de BEC cultivadas con Ki-67+ tratadas con vehículo o E2, con o sin tratamiento con etomoxir (n = 5). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. g, imágenes confocales representativas de vasos de tipo H (Emcnhigh/CD31high) en ratones tratados con vehículo y tratados con etomoxir; cuantificación de CE tipo-H normalizadas al área de la metáfisis (mp) (n = 5). Los datos son media ± sd; Prueba t de dos colas para datos no apareados. EC totales (CD31+CD45−Ter119−) cuantificadas por citometría de flujo (n = 5). Los datos son media ± sem; Prueba t de dos colas para datos no apareados. Barras de escala, 50 μm. PC, componente principal.

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Para comprender la regulación metabólica basal de las BEC, probamos las principales vías metabólicas que se sabe que regulan la angiogénesis en otros sistemas20,21,22. Verificamos los suplementos de nutrientes que podrían respaldar los BEC cultivados en ausencia de FA (sin suero), glucosa y glutamina. Descubrimos que la suplementación de BEC primarios con FA pero no con glucosa o glutamina mantuvo los BEC in vitro (Fig. 3e). El resultado nos llevó a investigar más a fondo e inhibir el metabolismo de FA en BEC. CPT1A, carnitina palmitoiltransferasa 1a, es una enzima limitante de la tasa de oxidación de AG mediante el transporte de AG a la mitocondria. El tratamiento con el inhibidor de CPT1A etomoxir redujo el crecimiento de BEC cultivados (Fig. 3f). De manera similar, la administración de etomoxir en ratones postnatales del día 10 (P10) durante 10 días redujo el crecimiento de vasos sanguíneos en los huesos (Fig. 3g). Para investigar el papel específico del endotelio óseo del metabolismo de FA, nos dirigimos genéticamente a CPT1A en EC utilizando ratones floxed Cpt1a21 criados con Cdh5 (PAC) CreERT2 específico de EC. La pérdida de la función CPT1A en BEC mostró una oxidación reducida de 3H-palmitato radiomarcado, lo que indica un metabolismo alterado de FA (Fig. 4a). El análisis de los vasos sanguíneos mostró una reducción en las EC totales y de tipo H de los huesos Cpt1aiΔEC en comparación con los controles de sus compañeros de camada, lo que indica un crecimiento defectuoso de los vasos sanguíneos (Fig. 4a). Además, los huesos mutantes Cpt1aiΔEC mostraron células OBL reducidas y adipocitos aumentados. El análisis de Micro-CT de huesos mutantes confirmó los cambios en el contenido óseo y lipídico (Datos extendidos, Fig. 6c), lo que sugiere la importancia del metabolismo endotelial de FA en la regulación de la MO.

a, Gráfico que muestra la oxidación de palmitato marcado con 3H por control y BEC con eliminación de Cpt1a. El gráfico muestra los niveles de ARNm de Cpt1a en BEC purificados de huesos mutantes Cpt1a iΔEC y de control. Imágenes confocales representativas de vasos de tipo H (Emcnhigh/CD31high) en mutantes de deleción de Cpt1a endoteliales y de control, con cuantificación del volumen de vasos sanguíneos de tipo H (control n = 6 F, n = 8 M; mutante n = 6 F, n = 5 M) y EC totales (CD31+CD45−Ter119−) caracterizados por citometría de flujo (control n = 6 F, n = 5 M; mutante n = 10 F, n = 5 M). Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes (volumen tipo H) y la media ± sem para los datos de 3H-palmitato, citometría de flujo y qPCR; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey realizada excepto los datos de 3H-palmitato (prueba t de dos colas no apareada). Barras de escala, 40 μm. b, Gráficos que muestran glucosa (vehículo n = 6, E2 n = 5), glutamina (vehículo n = 5, E2 n = 5) y palmitato (vehículo n = 6, E2 n = 6) oxidación en vehículos tratados y E2- BEC tratados, medidos por radiactividad (desintegraciones por minuto (dpm)). Los datos son media ± sem; Prueba t de dos colas para datos no apareados. c, Gráfico que muestra la oxidación de palmitato por BEC tratados con vehículo o E2, con o sin tratamiento con etomoxir (n = 5). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. d, imágenes confocales representativas que representan vasos de tipo H (Emcnhigh/CD31high) en ratones control y mutantes Cpt1aiΔEC tratados con E2. Barras de escala, 50 μm. Las cuantificaciones muestran EC tipo H normalizadas al área de mp (control n = 5 F, n = 5 M; mutante n = 5 F, n = 5 M) y EC totales (CD31+CD45−Ter119−) cuantificadas por citometría de flujo (control n = 5 F, n = 5 M; mutante n = 5 F, n = 5 M). Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes y la media ± sem para los datos de citometría de flujo; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. F, hembra; M, macho; pf, metáfisis.

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Luego investigamos cómo el estrógeno influyó en el metabolismo endotelial al tratar los BEC primarios con E2. E2 no alteró la dependencia de FA de BEC en condiciones de agotamiento de nutrientes (Fig. 3e). Además, el aumento de la oxidación de 3H-palmitato en comparación con la oxidación inalterada de 14C-glucosa o 14C-glutamina sugirió que el tratamiento con E2 promovió el uso de FA (Fig. 4b). En particular, etomoxir inhibió la proliferación celular mediada por E2 (Fig. 3f) y la oxidación de FA (Fig. 4c). Para comprender la relación in vivo, administramos E2 en ratones mutantes Cpt1aiΔEC para investigar la angiogénesis. La administración de E2 no recuperó la angiogénesis inhibida en los huesos mutantes Cpt1aiΔEC, lo que respalda la dependencia de FA aguas abajo del crecimiento de vasos sanguíneos mediado por E2 (Fig. 4d), mientras que E2 aumentó las células OBL y redujo los adipocitos en el compartimento mesenquimatoso (Datos extendidos Fig. 6d) . Juntos, los datos indicaron que el estrógeno requería FA para impulsar la angiogénesis en los huesos.

Se sugirió que los adipocitos de la médula ósea liberan ácidos grasos libres como fuente de energía para las células hematopoyéticas23. Identificamos que los BEC expresaron la proteína de unión a ácidos grasos 4 (FABP4), un transportador de lípidos de membrana involucrado en la captación, transporte y metabolismo de FA (Fig. 5a). Los huesos tratados con E2 mostraron una regulación positiva de la expresión de FABP4 en sus vasos sanguíneos (Fig. 5b y datos extendidos Fig. 7a), lo que nos llevó a investigar el transporte de lípidos en BEC. Para analizar la captación de FA en BEC, proporcionamos un pulso corto de 30 minutos de FA sintéticos conjugados con BODIPY en el medio. La detección de niveles altos de BODIPY en BEC tratados con E2 en comparación con los controles indicó la promoción de la absorción de FA por parte de E2 (Fig. 5c y Datos extendidos Fig. 7b). También verificamos los niveles de FA en BEC después del tratamiento con E2 usando LipidTOX. La detección de más BEC con altos niveles de lípidos intracelulares apoyó la absorción de lípidos en el tratamiento con E2 (datos extendidos, Fig. 7c). Para comprender el papel funcional de FABP4 en la absorción de FA, tratamos BEC con el inhibidor farmacológico de FABP4 BMS-309403 en presencia y ausencia de E2. Los niveles reducidos de BODIPY en BEC tratados con BMS-309403 (Fig. 5c) indicaron la participación de FABP4 en la captación de FA mediada por E2. Además, investigamos la captación de lípidos en presencia del inhibidor de señalización ER G36, un antagonista farmacológico de GPER1. La captación de BODIPY deteriorada en BEC tratados con G36 confirmó el transporte de lípidos como un mecanismo aguas abajo de la señalización de ER (Datos extendidos Fig. 7d). Además, la expresión reducida de FABP4 en los vasos sanguíneos de ratones mutantes Esr1iΔEC y Gper1iΔEC (Datos extendidos Fig. 7e) indicó la asociación entre la captación defectuosa de FA y la angiogénesis reducida.

a, Proyección de máxima intensidad de la imagen confocal que muestra la superposición de la expresión de FABP4 (verde) en la superposición de las CE óseas con la expresión de Emcn (rojo). Barras de escala, 50 μm. b, Los gráficos muestran la cuantificación de los niveles de proteína FABP4 observados en secciones de tejido óseo de huesos tratados con vehículo y tratados con E2 (n = 5) con microscopía confocal. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. Los niveles de transcripción se cuantificaron a partir de EC de hueso aislado de ratones administrados con vehículo y E2 (n = 5) mediante qPCR. Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. c, Imágenes confocales representativas de la captación de lípidos de FA sintéticos conjugados con BODIPY en BEC tratados con vehículo y tratados con E2 tras el tratamiento con el inhibidor de FABP4 BMS-309403. Barras de escala, 15 μm. La cuantificación muestra unidades de fluorescencia reducidas (FU, intensidad) de BODIPY endotelial tras la inhibición de FABP4 en múltiples campos de visión ×63 (vehículo n = 37; vehículo + BMS-309403 n = 36; E2 n = 41; E2 + BMS-309403 n = 42). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. d, Imágenes confocales representativas de adipocitos BM (perilipina+, verde) de huesos jóvenes y envejecidos. Barras de escala, 50 μm. Los gráficos muestran el número medio de adipocitos perilipina+ (n = 17), el tamaño (n = 15) y la cuantificación de la intensidad de la fluorescencia, lo que indica una disminución de la enzima lipolítica ATGL en ratones de edad avanzada (n = 84 F, 52 M) en comparación con ratones jóvenes (n = 50 F, 58 M) por celda en múltiples campos de visión ×20. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. e, Imágenes confocales representativas de adipocitos BM (perilipina+), con cuantificación de la intensidad de la fluorescencia que indica una disminución de la enzima lipolítica HSL en ratones de edad avanzada (HSL n = 120 F, 168 M) en comparación con ratones P28 (HSL n = 78 F, 88 M ) por celda a través de múltiples campos de visión ×20. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. Barras de escala, 50 μm. F, hembra; M, macho; Plin, perilipina.

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La captación defectuosa de FA y la angiogénesis en BEC de huesos mutantes Esr1iΔEC y Gper1iΔEC se asociaron con la acumulación de adipocitos en el microambiente. La disminución relacionada con la edad en la angiogénesis y la osteogénesis6,7,9,24,25 implicó un aumento simultáneo de adipocitos26,27. El estado angiogénico reducido de los huesos envejecidos se asocia con un aumento en el número y tamaño de los adipocitos en la MO. Por el contrario, los huesos jóvenes con alta angiogénesis mostraron adipocitos más pequeños y menos, lo que indica una relación inversa entre EC angiogénicos y adipocitos (Fig. 5d, e). Los adipocitos más pequeños presentes en huesos jóvenes mostraron una alta expresión de las enzimas lipolíticas triglicérido lipasa adiposa (ATGL) y lipasa sensible a hormonas (HSL) en comparación con los adipocitos más grandes presentes en huesos envejecidos. Por lo tanto, los adipocitos limitados presentes en los huesos angiogénicos jóvenes mostraron altos niveles de enzimas lipolíticas. Asimismo, los huesos envejecidos con angiogénesis reducida mostraron niveles bajos de lipasas lipolíticas en sus adipocitos (Fig. 5d, e).

Se ha demostrado previamente que los adipocitos expresan ER y responden a los niveles de estrógeno circulantes28,29. Sin embargo, la variación del número de adipocitos en mutantes endoteliales (ver fenotipos de adipocitos de ratones Esr1iΔEC, Gper1iΔEC y Cpt1aiΔEC) nos llevó a investigar la expresión de enzimas lipolíticas en estos mutantes. Los adipocitos presentes en los huesos mutantes Cpt1aiΔEC y Gper1iΔEC mostraron niveles bajos de lipasas lipolíticas (Datos ampliados, Fig. 8a). Los datos indicaron la participación de las BEC en la regulación de la lipólisis de los adipocitos en la MO. Para identificar posibles señales derivadas de EC que actúan sobre los adipocitos, se analizaron BEC aislados para determinar la expresión de factores lipolíticos. Los BEC purificados de ratones a los que se administró E2 mostraron una regulación positiva de Tnfa e Il6, que son factores lipolíticos paracrinos bien reconocidos. La señalización de ER deteriorada en BEC mutantes Esr1iΔEC y Gper1iΔEC mostró una regulación negativa de los niveles endoteliales de Tnfa e Il6 (Datos extendidos Fig. 8b). La expresión reducida de estos factores lipolíticos apoyó la acumulación de adipocitos en estos huesos mutantes. Del mismo modo, el tratamiento con E2 de BEC cultivadas in vitro liberó niveles más altos de TNF-α e IL-6 en el medio en comparación con el tratamiento de control (Datos ampliados, Fig. 8c), lo que confirma su liberación angiocrina de BEC. La angiogénesis disminuida y, por lo tanto, el uso de lípidos en BEC se asocia con la lipólisis reducida y la acumulación de adipocitos en la MO. Estos datos sugieren una interacción metabólica entre la angiogénesis y la lipólisis en la MO.

El envejecimiento esquelético está asociado con cambios en los vasos sanguíneos que contribuyen a la pérdida ósea9,24,25. La disminución relacionada con la edad en los niveles de estrógeno30,31,32,33 condujo a una pérdida ósea severa en las mujeres. Se ha demostrado que la administración de estrógeno previene la pérdida ósea relacionada con la edad34,35,36,37. La administración de E2 en ratones envejecidos promovió EC totales, capilares tipo H y células OBL y disminuyó los adipocitos (Datos extendidos Fig. 9a). También notamos un aumento en las arteriolas y los vasos transcorticales en los huesos de los ratones a los que se les administró E2 (Datos extendidos, Fig. 9b). El aumento asociado con la edad en las especies reactivas de oxígeno celular (ROS)38 ha sido ampliamente reconocido. Sorprendentemente, la administración de E2 en ratones envejecidos redujo significativamente los niveles de ROS endoteliales en los vasos sanguíneos (Fig. 6a). Un análisis posterior mostró la acumulación de LPO en los BEC envejecidos, como se evidencia mediante el uso de niveles de 4-hidroxinonenal39 (HNE) y BODIPY 665/676, un sensor de LPO. Encontramos niveles reducidos de LPO en BEC de ratones administrados con E2 (Fig. 6b, c y Datos extendidos Fig. 9c). Del mismo modo, un aumento en la HNE endotelial de los huesos inducidos por la menopausia abogó por la alta peroxidación de lípidos en condiciones de agotamiento de estrógenos (Datos extendidos Fig. 9d).

a, Gráficos de citometría de flujo representativos de la generación de ROS en EC de ratones tratados con vehículo (n = 8 F, n = 8 M) y ratones tratados con E2 (n = 7 F, n = 7 M). Los picos rojos en las gráficas de histograma indican células no teñidas. Las cuantificaciones muestran una reducción de ROS tras el tratamiento con E2. Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. b, Cuantificaciones de los niveles de 4-HNE en EC de la inmunotinción en ratones jóvenes tratados con vehículo (n = 5 F, n = 5 M) y ratones tratados con E2 (n = 5 F, n = 5 M) y ratones tratados con vehículo envejecido ratones (n = 5 F, n = 5 M) y ratones tratados con E2 (n = 5 F, n = 5 M), que muestran una reducción en los niveles de 4-HNE tras el tratamiento con E2. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. c, Gráficas de citometría de flujo representativas de la generación de LPO en EC de ratones jóvenes tratados con vehículo (n = 5 F, n = 5 M) y ratones tratados con E2 (n = 5 F, n = 5 M) y ratones viejos tratados con vehículo (n = 6 F, n = 5 M) y ratones tratados con E2 (n = 5 F, n = 5 M). Los picos rojos en las gráficas de histograma indican células no teñidas. Las cuantificaciones muestran una reducción de la LPO tras el tratamiento con E2. Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. d, Gráfico que muestra las diferencias de sexo en las concentraciones de iones ferrosos intracelulares en BEC de ratones tratados con vehículo y tratados con E2 (n = 4). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. e, Gráficos representativos de citometría de flujo con cuantificaciones que muestran diferencias de sexo en iones ferrosos intracelulares en BEC en ratones P10 (n = 6 F, n = 8 M) y ratones envejecidos (n = 6 F, n = 4 M). Los datos son media ± sem; Prueba t de dos colas para datos no apareados. f, Gráficos representativos de citometría de flujo con cuantificaciones que muestran un aumento en las EC de tipo H (CD31 alto/Emcn alto) con tratamiento con Lip-1 en ratones de edad avanzada (vehículo n = 6 F, n = 5 M; Lip-1 n = 5 F, n = 5M). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. g, Gráficos representativos de citometría de flujo de poblaciones BEC de ratones envejecidos tratados con vehículo y tratados con Lip-1. Las cuantificaciones son de CE con ROS lipídicas (vehículo n = 6 F, n = 4 M; Lip-1 n = 4 F, n = 4 M), lo que indica una reducción tras el tratamiento con Lip-1. Los picos rojos en las gráficas de histograma indican células no teñidas. Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. F, hembra; M, macho.

Datos fuente

Se ha demostrado que FABP4 contribuye a la protección contra el estrés oxidativo al reducir el ROS40 celular. En particular, la administración de E2 mejoró la expresión de FABP4 en el endotelio óseo envejecido e indicó una posible relación entre FABP4 y LPO en BEC (datos extendidos, figura 10a). La inhibición de FABP4 en BEC mostró acumulación de HNE, lo que sugiere su participación en la generación de LPO (Datos extendidos, Fig. 10b). La suplementación con E2 no pudo reducir la acumulación de HNE mediada por FABP4, lo que indica la dependencia de FABP4 de la función E2 (datos extendidos, figura 10b). Además, los datos defendieron la investigación de la función E2 en la regulación de múltiples mecanismos celulares que dan como resultado la generación de peróxidos.

Los niveles celulares de Fe2+ contribuyen a la generación de LPO en las células a través de un mecanismo dependiente de ferroptosis41,42. Para comprender la contribución de Fe2+ en el aumento relacionado con la edad en los niveles de LPO endoteliales, investigamos la concentración de Fe2+ en BEC masculinos y femeninos. La concentración intracelular de Fe2+ lábil fue mayor en los BEC machos purificados en comparación con las hembras y no se vio alterada por el tratamiento con E2 en los BEC jóvenes (Fig. 6d). Luego usamos el etiquetado de FeRhoNox-1 para detectar y cuantificar los niveles de Fe2+ en BEC. El marcaje con FeRhoNox-1 también detectó niveles elevados de Fe2+ en BEC de machos jóvenes en comparación con las hembras. Curiosamente, la cuantificación en huesos envejecidos mostró un mayor porcentaje de BEC Fe2+ en mujeres envejecidas en comparación con los hombres (Fig. 6e). El cultivo de BEC primarios con mesilato de deferoxamina (DFM), un quelante de hierro, resultó en la reducción de los niveles de LPO endoteliales. En consecuencia, la inducción de la producción de peróxido mediada por Fe2+ utilizando artemisinina aumentó los niveles de LPO endoteliales. El tratamiento con E2 redujo los niveles de LPO en BEC tratados con DFM y tratados con artemisinina in vitro (Datos ampliados, Fig. 10c). Se ha demostrado que DFM promueve los vasos de tipo H y la osteogénesis en ratones de edad avanzada9. Encontramos niveles reducidos de LPO en BEC de ratones administrados con DFM (Datos extendidos Fig. 10d). Del mismo modo, el tratamiento con artemisinina (200 mg kg−1) en ratones jóvenes condujo a una reducción de los capilares tipo H y las células OBL sin cambios en los adipocitos (Datos ampliados, Fig. 10e). Estos datos sugirieron el papel de Fe2+ en la producción de LPO endotelial y, por lo tanto, el fenotipo de envejecimiento de los vasos sanguíneos en el hueso.

Los altos niveles basales de Fe2+ en EC de mujeres de edad avanzada podrían agravar la producción de LPO y la pérdida de tipo H y hueso en condiciones de agotamiento de estrógenos, como la menopausia. La reducción de la producción de LPO por E2 (Fig. 6b, c) sugirió un mecanismo potencial subyacente a los beneficios clínicos de la terapia de reemplazo hormonal (TRH) para la pérdida ósea posmenopáusica. Para probar esto, nos dirigimos farmacológicamente a la producción de LPO usando liproxstatin-1 (Lip-1), un inhibidor de peróxido de lípidos, en ratones de edad avanzada. Los ratones envejecidos tratados con control de vehículo contenían pocos vasos de tipo H en comparación con los ratones a los que se les administró Lip-1 (10 mg kg-1), que mostraron un aumento en los capilares angiogénicos (Fig. 6f). El análisis de los niveles de ROS en BEC demostró una reducción en los huesos tratados con Lip-1 (Fig. 6g). Además, el aumento de los capilares tipo H mediado por Lip-1 se asocia con el aumento de las células OBL y la reducción de los adipocitos en los huesos envejecidos (Fig. 7a). El análisis de micro-CT de huesos envejecidos confirmó el aumento observado en el hueso y la reducción en el contenido de lípidos de los ratones tratados con Lip-1 (Fig. 7b y datos extendidos, Fig. 10f).

a, Imágenes confocales representativas de BM en ratones envejecidos tratados con Lip-1, con gráficos que muestran la cuantificación del volumen del vaso tipo H por campo de mp (vehículo n = 5 F, n = 5 M; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M), células osterix+ por mm de mp (vehículo n = 5 F, n = 5 M; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M) y perilipin+ área por mm de área (vehículo n = 5 F, n = 5 M; Labio-1 n = 5 F, n = 5 M). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. Barras de escala, 40 μm (vehículo) y 50 μm (Lip-1). b, Imágenes representativas de micro-CT de huesos de ratones envejecidos tratados con Lip-1, con gráficos que muestran la cuantificación del volumen, número, grosor y separación del hueso trabecular (n = 4) y volumen de adipocitos (n = 4). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. F, hembra; M, macho; Osx, osterix; Plin, perilipina.

Datos fuente

En este estudio, encontramos que el estrógeno juega un papel importante en la mediación del crecimiento de los vasos sanguíneos al promover el metabolismo de los AG en las BEC (Fig. 8). Los estudios genéticos de pérdida de función de ER indican la señalización de estrógenos constituyentes en la vasculatura ósea de BEC masculinos y femeninos y abogan firmemente por investigar su dependencia de la dosis, interacciones y redundancia en la mediación de la señalización posterior.

El estrógeno regula el crecimiento de los vasos sanguíneos en el hueso a través de ESR1 y GPER1 endoteliales. La señalización de ER regula el uso del metabolismo de FA por parte de las CE al promover la liberación angiocrina de factores lipolíticos, enzimas y la absorción de FA del microambiente. El metabolismo de lípidos deteriorado en el endotelio envejecido y las diferencias sexuales en los niveles de iones ferrosos endoteliales estimulan el fenotipo de envejecimiento en los vasos sanguíneos de los huesos.

La angiogénesis en huesos en crecimiento activo está relacionada con un número limitado de adipocitos, y la disminución de la angiogénesis relacionada con la edad está asociada con la acumulación de adipocitos en el hueso. En las mujeres, se ha identificado que el tratamiento con estrógenos provoca lipólisis y reduce el contenido de lípidos de la médula ósea43. El papel de los estrógenos en la regulación de los adipocitos óseos ha sido ampliamente reconocido. Aquí mostramos una asociación previamente desconocida entre los vasos sanguíneos y los adipocitos. Encontramos que la inhibición del metabolismo de los lípidos en BEC condujo a un aumento de adipocitos en el BM. En modelos animales menopáusicos, la reducción de la angiogénesis se asocia con la acumulación de adipocitos, similar al envejecimiento en humanos. Nuestros datos proponen que el estrógeno podría regular el acoplamiento metabólico para mantener el equilibrio energético en la MO al impulsar la lipólisis para el crecimiento de los vasos sanguíneos.

La naturaleza específica de tejido del envejecimiento vascular44 aún se encuentra en las etapas iniciales de comprensión. Descubrimos que los niveles intrínsecos de iones ferrosos podrían acelerar el envejecimiento de los BEC y contribuir a la pérdida ósea observada en las mujeres mayores en comparación con los hombres. La naturaleza dependiente de hierro y no hemo de las lipoxigenasas corrobora la importancia del hierro en los niveles de LPO endoteliales. En general, el estrógeno es un factor clave que limita la acumulación de LPO en BEC. Los efectos combinados de estrógeno reducido, iones ferrosos y LPO contribuyen al envejecimiento acelerado en las mujeres. Este estudio respalda la noción fundamental de investigar las diferencias sexuales en la vasculatura para comprender el sesgo de género observado en la incidencia de enfermedades cardiovasculares relacionadas con la edad. Los hallazgos de este estudio identifican a los LPO como un objetivo posterior del estrógeno y sugieren que apuntar a los LPO podría ser una estrategia alternativa a la TRH para tratar la pérdida ósea posmenopáusica y la reparación ósea. Además, el conocimiento fundamental de las diferencias sexuales del endotelio óseo puede ser beneficioso para desarrollar una medicina de precisión contra las enfermedades de la sangre y los huesos.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y leyes institucionales, siguiendo los protocolos aprobados por el Organismo de Revisión Ética y de Bienestar Animal del Imperial College London y el Ministerio del Interior del Reino Unido. Todos los experimentos de tipo salvaje se realizaron en ratones C57BL/6J y fueron emparejados por edad y sexo. Todos los ratones transgénicos fueron emparejados por edad y sexo para cada experimento.

Para los experimentos de embarazo, el inicio del embarazo se determinó por la presencia de un tapón vaginal. Los ratones se sacrificaron en días relevantes después de la identificación del tapón vaginal, junto con hembras vírgenes y ratones machos como controles.

Para los tratamientos hormonales, a los ratones se les inyectaron por vía subcutánea (sc) 2 μg de 17β-estradiol (Acros Organics), 1 mg de progesterona (Acros Organics) o 100 μg de DHT (TCI) disueltos en etanol y aceite de maíz (100 μl). Los ratones del vehículo recibieron la dosis equivalente de etanol en aceite de maíz. Las crías (P10) recibieron diez inyecciones intermitentes y los ratones de edad avanzada (65–75 semanas) recibieron tres inyecciones por semana durante 6 semanas. A los ratones inyectados con 17β-estradiol se les inyectó por vía intraperitoneal (ip) EdU (250 mg ml-1) 3 horas antes del sacrificio para identificar las EC que estaban proliferando. Las crías (P10) recibieron diez dosis de 10 μg de letrozol (Sigma-Aldrich) en DMSO para el tratamiento anti-aromatasa.

Para el modelo de menopausia murina, se inyectaron ratones hembra con 160 mg kg-1 día-1 de diepóxido de 4-vinil ciclohexeno (Fluorochem) durante 20 días y se dejaron durante 32 días más para inducir una atresia folicular completa. Se tomaron muestras vaginales diariamente para confirmar la persistencia del diestro. A los ratones de control se les inyectó PBS.

Se adquirieron ratones OVX de Charles River Laboratories UK. La ovariectomía se realizó en ratones C57BL/6J de tipo salvaje. Las cohortes E2 recibieron 17β-estradiol 2 semanas después de la cirugía durante 4 semanas (tres inyecciones por semana), mientras que las cohortes de control recibieron inyecciones de vehículo.

DFM se administró a 25 μg g-1 peso de ratones ip durante 2 semanas en días alternos. Los ratones se sacrificaron el día después de la última inyección para su análisis. Para inhibir CPT1A, se inyectó ip etomoxir a 30 mg kg−1 durante 10 días y los ratones se sacrificaron en P28.

Para la eliminación específica del endotelio de los ER, se cruzaron ratones condicionales Esr1lox/lox, Esr2lox/lox o Gper1lox/lox con ratones transgénicos Cdh5(PAC)-CreERT2. La actividad de Cre fue inducida por inyecciones de tamoxifeno (80 mg kg-1) de ratones P10-P14, y los ratones se analizaron en P28. A los ratones Littermate Cre- también se les inyectó tamoxifeno y se usaron como controles. De manera similar, los ratones Cpt1alox/lox condicionales se criaron con ratones transgénicos Cdh5(PAC)-CreERT2 para la eliminación específica del endotelio, y los ratones se analizaron en P28. Para inducir la actividad de Cre en la etapa adulta, se inyectaron ratones de P66 a P70 y se sacrificaron en P84.

Para inducir la generación de LPO en ratones jóvenes, las crías (P10) recibieron cinco inyecciones ip intermitentes de artemisinina (TCI, 200 mg kg−1) en DMSO. Los ratones envejecidos recibieron 15 dosis de Lip-1 (Tocris Bioscience, 10 mg kg−1) ip durante 4 semanas para inhibir la producción de LPO.

Las tibias se disecaron y limpiaron y se sometieron a una fijación inmediata durante 4 horas en hielo en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4%, seguido de una descalcificación con EDTA 0,5 M con agitación constante a 4 °C. A continuación, los huesos se mantuvieron en una solución crioconservadora (sacarosa al 20 % (p/v) y polivinilpirrolidina (PVP) al 2 % (p/v)) durante 48 horas más. Para el crio-sección, los huesos se incluyeron en gelatina al 8 % (p/v), sacarosa al 20 % (p/v) y PVP al 2 % (p/v). Se utilizó un criostato Leica para generar secciones de 70 μm en portaobjetos microscópicos utilizados para la inmunotinción.

Para los análisis fenotípicos de las tibias por inmunohistoquímica, las secciones óseas se hidrataron con PBS, seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,25 % durante 10 minutos y bloqueo con suero de burro (DS) al 5 % durante 30 minutos. El anticuerpo primario se diluyó en DS al 5 % y se incubó durante 2,5 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados incluyeron antiendomucina (Santa Cruz Biotechnology, 1:100), anti-osterix (Abcam, 1:600), anti-CD31 (R&D Systems, 1:100), antiperilipina (Cell Signaling Technology, 1: 100), antiperilipina (GeneTex, 1:100), anti-Ki-67 (Abcam, 1:100), antilaminina (Sigma-Aldrich, 1:100), anti-FABP4 (R&D Systems, 1:100 ), anti-4-hidroxinonenal (Abcam, 1:200), anti-HSL (Cell Signaling Technology, 1:50), anti-ATGL (Cell Signaling Technology, 1:100), anti-CD45 (BD Pharmingen, 1: 100) y anti-Itgb3 (Tecnología de Señalización Celular, 1:100).

A continuación, los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo diluido en DS al 5 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios utilizados incluyeron Alexa Fluor 594 anti-rata (Invitrogen, A21209, 1:400), Alexa Fluor 488 anti-rata (Invitrogen, A21208, 1:400), Alexa Fluor 488 anti-cabra (Invitrogen, A11055, 1:400) ), anti-cabra Alexa Fluor 546 (Invitrogen, A11056, 1:400), anti-cabra Alexa Fluor 647 (Invitrogen, A21447; 1:400), anti-conejo Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21206, 1:400), anti-rabbit Alexa Fluor 546 (Invitrogen, A10040, 1:400) y DAPI para tinción nuclear. Los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS durante 10 minutos cada uno y luego se montaron con un cubreobjetos usando solución Fluoromount G (Southern Biotech).

El etiquetado de EdU se realizó mediante la química Click-iT (Invitrogen, C10340) siguiendo las pautas del fabricante, después de las incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios.

Se adquirieron imágenes tridimensionales (3D) de alta resolución usando un microscopio de escaneo láser confocal Leica TCS SP8 usando el software Leica LASX.

Recolectamos tibias y fémures frescos de mutantes y sus compañeros de camada de control o de ratones de control y tratados para el análisis de fenotipo usando micro-CT. Los huesos recién aislados se limpiaron minuciosamente y se fijaron en PFA al 4%. Para analizar las regiones mineralizadas en los huesos, se utilizaron huesos fijos para la exploración por micro-CT. Para el análisis de lípidos, realizamos el marcaje con tetróxido de osmio. En resumen, los huesos fijados se descalcificaron en una solución de EDTA durante 3 a 10 días y se tiñeron con una solución de tetróxido de osmio al 2% durante 48 horas. A continuación, los huesos se lavaron minuciosamente y se almacenaron hasta su análisis. Los huesos se escanearon usando micro-CT de haz cónico de gabinete (μCT 100, Scanco Medical) y software IPL versión 5.15 en Scanco Medical. Se eligió un tamaño de vóxel de 10 μm en las tres dimensiones espaciales. Para cada muestra se evaluaron al menos 400 cortes cubriendo más de 4 mm a un voltaje de 70 kVp, intensidad de 114 μA, 8 W y tiempo de integración de 800 ms. Para la evaluación, se eligió como volumen de interés una longitud de 3 mm por debajo de la placa de crecimiento.

Las tibias y los fémures se diseccionaron y se recogieron en PBS enfriado con hielo y se lavaron posteriormente con PBS estéril en condiciones estériles. Los huesos se trituraron con un mortero y una maja, y los restos óseos restantes se digirieron con colagenasa durante 20 minutos a 37 °C y se filtraron juntos para obtener una suspensión unicelular. Se realizó la lisis de glóbulos rojos (RBC) (ChemCruz) (5 minutos, temperatura ambiente) para eliminar los RBC, y luego las células totales se sedimentaron y se mantuvieron en hielo.

Los BEC se aislaron usando Dynabeads oveja anti-rata IgG (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, las perlas se recubrieron primero con endomucina de rata (Santa Cruz Biotechnology) durante 45 minutos en un rotador a 4 °C, se lavaron con tampón de aislamiento (0,1 % FBS-PBS) en una rejilla magnética y luego se incubaron con células totales durante 30 minutos. en un rotador a 4 ° C para aislar ECs solamente. La mezcla se lavó con tampón de aislamiento en una gradilla magnética para aislar una selección positiva de células que expresan endomucina y se sembró en placas de cultivo celular recubiertas con fibronectina (Sigma-Aldrich) en medio basal EBM-2 (Lonza) complementado con crecimiento EGM-2. medio (2% FBS, 0,4% hFGF-B, 0,1% VEGF, 0,1% R3-IGF-1, 0,1% ácido ascórbico, 0,1% hEGF, 0,1% heparina y 0,04% hidrocortisona). Las células se pasaron cada 3 o 4 días usando tripsina-EDTA al 0,25 % (Sigma-Aldrich).

Para este experimento se usaron BEC cultivadas en medio completo EGM2 durante 1 día. Después de lavar con HBSS, las células se trataron con vehículo (DMSO) o con 17β-estradiol (10 μM) durante 16 horas en medio EC sin glucosa, sin glutamina y sin suero (Cell Biologics) y se complementó con glucosa 5 mM. , glutamina 2 mM o ácido linoleico-ácido oleico 20 mM (Sigma-Aldrich) para determinar el efecto de la suplementación con nutrientes en el crecimiento celular. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-Ki-67 (Abcam, 1:300) para medir la proliferación de EC o con anticuerpo anti-caspasa-3 escindida (Cell Signaling Technology, 1:300) para medir la apoptosis.

Los BEC cultivados en cubreobjetos se trataron con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol durante 60 horas y luego se incubaron con BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) o se tiñeron con HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific, 1:1000). ) durante 30 minutos a 37 °C. Las células se lavaron y montaron en portaobjetos y se tomaron imágenes usando un microscopio confocal Leica TCS SP8.

Los BEC cultivados en cubreobjetos se trataron con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol junto con etomoxir (100 μM). Las células se tiñeron con anticuerpo anti-Ki-67 (Abcam, 1:300) para medir la proliferación de EC o con anticuerpo anti-caspasa-3 escindida (Cell Signaling Technology, 1:300) para medir la apoptosis.

Los BEC cultivados en cubreobjetos se trataron con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol junto con BMS-309403 (10 μM). Las células se tiñeron con BODIPY 558/568 C12 para determinar si se redujo la captación de lípidos.

Los BEC cultivados en cubreobjetos se trataron con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol junto con G36 (Tocris Bioscience, 10 μM) durante 60 horas y luego se tiñeron para BODIPY 558/568 C12 como se explica para la absorción de lípidos.

Se cultivaron BEC de huesos masculinos y femeninos por separado y se trataron con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol durante 60 horas antes del ensayo. Los BEC se recogieron mediante tripsinización y centrifugación y se lisaron mediante sonicación y se resuspendieron en tampón de ensayo de hierro (Abcam, ab8366). El ensayo se realizó según las directrices del fabricante para el ensayo de hierro (II) con densidad óptica (OD) medida a 593 nm y hierro (II) contenido determinado por una curva estándar.

Los LPO generados por reacciones redox de iones ferrosos se midieron mediante un ensayo colorimétrico (Cayman Chemical, 705003) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, las EC totales se aislaron de los huesos de ratones jóvenes y viejos tratados con vehículo o E2 como se explicó anteriormente utilizando Dynabeads y se lisaron mediante sonicación al retirar las perlas. Siguió una extracción de metanol:cloroformo, tomando la capa de cloroformo para que reaccionara con iones de tiocianato para detectar LPO generados midiendo la DO a 500 nm usando el lector de microplacas FLUOstar Omega 3.0.

La concentración de 17β-estradiol se determinó a partir de suero sanguíneo mediante ELISA (Abcam, ab108667) según el protocolo del fabricante. La sangre circulante se recogió de ratones y se dejó coagular durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos para obtener suero. El conjugado de 17β-estradiol-HRP se añadió a muestras o estándares y se incubó durante 2 horas a 37 °C. Después de lavar todas las muestras, se añadió sustrato TMB y se incubó durante 30 minutos más a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de una solución de parada y se midió la DO a 450 nm para cuantificar la concentración de E2 usando una curva estándar.

El sobrenadante se recolectó de BEC cultivados tratados con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol para medir la concentración de TNFα (R&D Systems, MTA00B) e IL-6 (R&D Systems, M6000B) liberados mediante ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Específicamente, se añadió diluyente de ensayo a los estándares o muestras y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar todas las muestras, se añadió el conjugado de proteína respectivo durante 2 horas, seguido de un lavado adicional e incubación con solución de sustrato durante 30 minutos. La DO se midió a 540 nm y 450 nm (se restó la corrección de la longitud de onda) y las concentraciones de proteína se determinaron mediante una curva estándar.

Los fémures se diseccionaron y se trituraron con un mortero y una maja en PBS enfriado con hielo. La solución de médula ósea se pasó a través de un filtro de 100 μm y se sedimentó. La lisis de glóbulos rojos (ChemCruz) siguió como se explicó anteriormente. Las células se resuspendieron en PBS y se tiñeron para EC totales: anticuerpo primario CD45 (BD Pharmingen, 1:100) o EC tipo H: anticuerpo primario endomucina (Santa Cruz Biotechnology, 1:50) y anticuerpo secundario Brilliant Violet-421 (Jackson ImmunoResearch , 1:50) junto con CD31-PE (Miltenyi Biotec, 1:20) o CD31-APC (Miltenyi Biotec, 1:20). La tinción mitocondrial se realizó después de incubaciones de anticuerpos con MitoSOX (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) durante 15 minutos a 37 °C. Las células se pasaron por el citómetro de flujo BD LSR II utilizando el software BD FACSDiva 9.0.0.

Para la tinción con FABP4, se añadió anti-FABP4-AF488 (Santa Cruz Biotechnology, 1:50) junto con anti-CD31-PE después de la incubación primaria con anti-CD45.

Para la tinción con Ki-67, las células se tiñeron como se explicó anteriormente para el endotelio total. Después de la tinción y los lavados del anticuerpo secundario, las células se fijaron, se permeabilizaron (BSA al 0,1 % y saponina al 0,01 %) y se tiñeron con Ki-67 anti-ratón FITC (BioLegend, 1:75) durante 45 minutos a temperatura ambiente, y las células se adquirieron en un citómetro de flujo BD LSR II.

Para detectar iones ferrosos intracelulares, las células se incubaron con FeRhoNox-1 (Goryo Chemical, 5 μM) durante 15 minutos a 37 °C después de teñir las EC totales.

Los BEC en cultivo, tratados con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol (10 μM) se tripsinizaron, sedimentaron e incubaron con BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) o HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific, 1: 1000) durante 30 minutos a 37 °C antes de la adquisición.

Para el sensor LPO, las células se tiñeron para determinar el endotelio total y luego se incubaron con BODIPY 665/676 (Thermo Fisher Scientific, 2 μg ml−1) durante 30 minutos a 37 °C antes de la adquisición.

Todos los análisis de citometría de flujo se realizaron con el software FlowJo 10.0.0. Las EC totales se seleccionaron para poblaciones CD31+CD45-Ter119-, y las EC tipo H se seleccionaron para poblaciones Emcnhigh/CD31high.

Se sembraron BEC a aproximadamente 25 000 células por pocillo para todos los experimentos de marcaje con radioisótopos y se trataron con vehículo (DMSO) o 17β-estradiol durante 48 horas antes del marcaje radiactivo. Para medir la oxidación de glucosa y glutamina, las células se incubaron con 0,3 μCi/ml de D-[6-14C]-glucosa (PerkinElmer) o 1,1 μCi/ml de L-[14C(U)]-glutamina (PerkinElmer) en medio de cultivo celular para 6 horas. Para detener el metabolismo celular, se agregaron 250 μl de ácido perclórico a cada pocillo con la adición de un papel de filtro empapado en hidróxido de hiamina para absorber el 14CO2 liberado por la oxidación de glucosa o glutamina durante la noche a temperatura ambiente. La radiactividad se determinó mediante recuento de centelleo líquido para indicar las desintegraciones por minuto. Para el estudio de oxidación de ácidos grasos, se usó etomoxir para inhibir CPT1A como se describió anteriormente. Para medir la oxidación del palmitato, las células se incubaron con 2 μCi/ml de [9,10-3H]-ácido palmítico (PerkinElmer) en el medio de cultivo celular durante 6 horas. El medio de cultivo celular se transfirió a viales de vidrio con papel de filtro colgante para absorber el 3H2O liberado durante 48 horas a 37 °C. La radiactividad se determinó mediante recuento de centelleo líquido (QuantaSmart) para indicar las desintegraciones por minuto.

Las pilas Z de imágenes se reconstruyeron en 3D y se analizaron utilizando el software Imaris Image Analysis versión 9.0.0. La cuantificación del área de Perilipin+ y tipo-H se realizó utilizando ImageJ (Fiji) en la proyección máxima de Z-stacks. Los números de células de Osterix+ se contaron automáticamente usando la función de detección de puntos al establecer un diámetro de umbral para los núcleos de osrerix+ para excluir el fondo usando Imaris. El volumen del vaso tipo H se cuantificó utilizando la función de superficies para generar superposiciones 3D de volúmenes Emcn+CD31+ en Imaris. Los CE de EdU+ se contaron automáticamente usando la función de detección de manchas en Imaris, de manera similar a los núcleos de osterix+, después de aplicar una máscara para los vasos sanguíneos de Emcn+ usando la función de superficies. Las CE Ki-67+ se cuantificaron de manera similar. La intensidad de fluorescencia media (MFI) para Emcn+ 4-HNE y FABP4 se generó automáticamente durante la reconstrucción 3D de las pilas Z para el análisis de volumen mediante la creación de una máscara para los vasos Emcn+. Los núcleos de células CD31+Ki-67+ se contaron usando la función de contador de células en ImageJ (Fiji). CD31+ 4-HNE (MFI) para células se generaron en ImageJ (Fiji) usando la densidad integrada y los valores medios de gris. Se restó la fluorescencia de fondo para obtener la intensidad de fluorescencia corregida por celda en varias imágenes. Plin+ ATGL y HSL (MFI) se calcularon de manera similar, utilizando la densidad integrada y los valores medios de gris por gota de lípido en varias imágenes para 4 o 5 muestras de hueso.

Las EC se aislaron con perlas recubiertas de anticuerpos, como se explicó anteriormente. En lugar de colocar las células en placas para el cultivo, las células se lisaron con tampón RLT (Qiagen) y se extrajo el ARN utilizando el kit RNeasy Plus Micro (Qiagen, 74034) según las instrucciones del fabricante. El ARN total se convirtió en ADNc usando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del kit. Se usó ADNc diluido para la qPCR realizada con SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) con cebadores para los siguientes genes: Tgfb, Eng, Tie1, Pecam1, Itga5, Flt4, Flt1, Fgfr2, Sox18, Nrp1, Adipoq, Fabp4, Cyp1b1, Lepr, Aldh1a2, TNFα e Il6. Se usó β-actina como gen de limpieza.

Para confirmar la pérdida de la función génica a nivel de transcripción para los experimentos de eliminación de genes, se aislaron EC de fémures de ratones transgénicos inyectados con tamoxifeno para qPCR utilizando cebadores para cada gen (Esr1, Esr2, Gper1 y Cpt1a). Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio se proporcionan en la Tabla complementaria 1.

Las reacciones se realizaron en una máquina de PCR en tiempo real CFX (Bio-Rad) usando el software CFX manager 3.1. Los datos se calcularon usando el método ΔΔCt para mostrar la expresión génica o los niveles relativos de ARNm.

Las CE óseas aisladas se lisaron utilizando tampón RLT. El ARN se extrajo utilizando el RNeasy Plus Micro Kit según las instrucciones del fabricante.

La calidad del ARN de cada muestra individual se comprobó utilizando un Bioanalizador 2100 (Agilent). Las tres muestras principales de cada conjunto en función de la calidad del ARN se procesaron más para las preparaciones de la biblioteca. Se utilizó el kit de preparación de bibliotecas de ARN total TruSeq (Illumina) para preparar bibliotecas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se secuenciaron en LMS Genomics Facility en una plataforma Illumina HiSeq 2500 con lecturas de extremos emparejados de 100 nucleótidos de longitud.

Análisis de datos: las lecturas de secuencias de ARN de 100 pb de extremos emparejados se alinearon utilizando el ensamblaje del genoma de ratón GRCm39 STAR (versión 2.7.10a)45. El recuento de lecturas basado en genes se obtuvo utilizando featureCounts (versión 2.0.1)46. Los datos de conteo se normalizaron usando la función de transformación de estabilización de varianza (VST) del paquete DESeq247 para visualización por PCA. El análisis de expresión génica diferencial entre hombres y mujeres para cada grupo de edad se realizó utilizando DESeq2. Los genes DE se seleccionaron (codificación de proteínas) utilizando una tasa de falso descubrimiento (FDR) ajustada P <0,05. Además, las ID de Ensembl se anotaron en los símbolos de genes y la ID de Entrez Gene usando biomaRt (ref. 48). La lista de genes regulados diferencialmente se proporciona en el Conjunto de datos complementario 1. El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes se realizó utilizando GAGE ​​(versión 2.42.0)19. Para la anotación funcional, utilizamos conjuntos de genes de la base de datos KEGG. El análisis GAGE ​​se realizó en genes regulados diferencialmente a partir de 65 semanas de datos, donde la muestra femenina se tomó como muestra de referencia. Los términos KEGG significativos se seleccionaron utilizando P < 0,05.

Se utilizó GraphPad Prism versión 9.4.1 para generar todos los gráficos y para el análisis estadístico. Las estadísticas realizadas para cada figura se mencionan en la leyenda de la figura correspondiente. Cuando se indicó, se realizaron las pruebas t no pareadas de dos colas de Student o ANOVA unidireccional o bidireccional después de la prueba de comparación múltiple de Tukey para los conjuntos de datos. Las barras de error para los datos biológicos indican la media ± sd y, para la cuantificación numérica, las barras de error indican la media ± sem P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Los tamaños de muestra se seleccionaron en base a experimentos previos y datos publicados. Todos los datos se generaron utilizando al menos dos experimentos independientes para reproducir resultados similares.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-seq generados para este estudio se han depositado en la base de datos Omnibus de expresión génica del Centro Nacional de Información Biotecnológica con los números de acceso GSE163515 y GSE180246. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo principal y los archivos asociados. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Damos las gracias a P. Carmeliet, SA Khan y RH Adams por proporcionar líneas de ratón y P. Carmeliet y G. Eelen por proporcionar el protocolo de ensayo radiactivo. Agradecemos a R. Eastell, I. Miguel-Aliaga y a todos los miembros del laboratorio de Ramasamy por sus interesantes debates. SKR es Sir Henry Dale Fellow de Wellcome Trust y la Royal Society (202300/Z/16/Z). SKR reconoce que esta investigación fue financiada en parte por Wellcome Trust (202300/Z/16/Z), la Royal Society (RGS\R2\212421), el Medical Research Council (A654-5QC60) y la American Society for Bone and Investigación de minerales. APK reconoce que el trabajo cuenta con el apoyo parcial del Consejo de Investigación Médica (CDA: MR/P02209X/1) y el Consejo Europeo de Investigación (StG: metaNiche, 805201). SKR es miembro del Programa de Jóvenes Investigadores de EMBO. Para fines de acceso abierto, hemos aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío.

Instituto de Ciencias Clínicas, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Julia Rodrigues, Michelle Hendriks y Saravana K. Ramasamy

MRC Instituto de Ciencias Médicas de Londres, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Julia Rodrigues, Michelle Hendriks y Saravana K. Ramasamy

Centro de Bioinformática y Computación, MRC Instituto de Ciencias Médicas de Londres, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Yi-Fang Wang y Gopuraja Dharmalingam

Grupo de Microambientes de Tejidos y Tumores, Unidad de Inmunología Humana MRC, Instituto Weatherall de Medicina Molecular MRC, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Amit Singh y Anjali P. Kusumbe

Centro de Bioquímica de la Universidad de Heidelberg, Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania

amit singh

Bioscar Inserm U1132 y Universidad de París, Hospital Lariboisiere, París, Francia

Martine Cohen-Solal

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JR diseñó y realizó la mayoría de los experimentos, interpretó los resultados y preparó figuras. Y.-FW, AS y GD analizaron datos de expresión génica. MH ordenó las células y preparó el manuscrito. APK diseñó experimentos e interpretó los resultados. Todos los autores prepararon el manuscrito. SKR concibió y supervisó el estudio, interpretó los resultados y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Saravana K. Ramasamy.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Nature Cardiovascular Research agradece a Philip Shaul, Joshua Farr y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Imágenes confocales representativas que muestran cambios en los OBL (Osterix+) y los adipocitos de la médula ósea (BM) (Perilipin+) en diferentes momentos durante el embarazo y el posparto del ratón. Barras de escala 40 μm. b, Cuantificación de los adipocitos OBL y BM descritos en a, normalizados a longitud y área de metáfisis (mp) respectivamente (n = 5). Los datos son media ± sd; ANOVA de una vía con prueba de Tukey. c, Cuantificación de Ki-67+ EC en diferentes puntos de tiempo durante el embarazo del ratón, normalizados a la longitud de mp (n = 5). Los datos son media ± sd; ANOVA de una vía con prueba de Tukey. d, Imágenes confocales representativas con cuantificaciones (n = 5) que muestran pérdida de OBL y aumento de adipocitos BM en el modelo VCD. Los datos son media ± sd; Prueba t de dos colas para datos no apareados. Barras de escala 40 μm. e, exploraciones de baldosas confocales representativas de vehículos y huesos tratados con E2 en P28, que ilustran el aumento de vasos de tipo H (puntas de flecha) en ratones tratados con E2. Las líneas punteadas blancas separan la médula ósea de la región del hueso cortical. Cuantificación de CE Tipo-H (CD31high Emcnhigh) caracterizada por citometría de flujo (n = 6). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 100 μm.

Datos fuente

a, Imágenes confocales representativas con cuantificaciones de OBL (Osterix+, n = 5) y adipocitos BM (Perilipin +, n = 5) de ratones tratados con diferentes hormonas en P28. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 40 μm. b, Las imágenes confocales representativas muestran vasos sanguíneos de endomucina (Emcn, rojo), CD31 (verde), actina de músculo liso alfa (αSMA, cian) en la metáfisis y el área del hueso cortical. Los gráficos muestran la cuantificación de CD31 + arteriolas Emcn- (puntas de flecha blancas) y TCV en ratones tratados con Vehículo, E2, P4 y DHT (n = 5); Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Las líneas punteadas blancas indican la región del hueso cortical. DAPI es una contratinción nuclear. Barras de escala de 100 μm (TCV); 50 μm (arteriolas). c, imágenes confocales representativas de vehículos inyectados con EdU y ratones tratados con E2 en P28, con cuantificación de EdU+ EC normalizados a longitud de metáfisis (mp) (Vehículo n = 4 F, n = 4 M; E2 n = 5 F, n = 4 M), lo que indica un aumento de las EC de EdU+ con el tratamiento con E2. Barras de escala de 50 μm. Gráficos representativos de citometría de flujo de Ki-67+ EC, con cuantificación de Ki-67+ EC en hueso (Vehículo n = 4 F, n = 4 M; E2 n = 6 F, n = 4 M) que indican un aumento en Ki- 67+ CE con tratamiento E2. Los datos de cuantificación de imágenes son la media ± sd con ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey, y los datos de citometría de flujo son la media ± sem con ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey. d, imágenes confocales representativas y cuantificación de núcleos Ki-67+ de BEC tratados con vehículo y E2 (vehículo n = 11, E2 n = 10) con cuantificación del promedio de múltiples campos de visión de 20x que indican un aumento en las células Ki-67+ con tratamiento E2. Los datos son media ± sd; Prueba t de dos colas para datos no apareados. Barras de escala de 50 μm. e, Gráfico que muestra la expresión génica relativa para genes angiogénicos en ratones tratados con Vehículo y E2, lo que indica un aumento en la angiogénesis tras el tratamiento con E2. (Tgfb Vehículo n = 8, E2 n = 5; Eng Vehículo n = 8, E2 n = 5; Tie1 Vehículo n = 6, E2 n = 5; Pecam1 Vehículo n = 8, E2 n = 5; Itga5 Vehículo n = 7 , E2 n = 5; Flt4 Vehículo n = 8, E2 n = 5; Flt1 Vehículo n = 5, E2 n = 4; Fgfr2 Vehículo n = 7, E2 n = 6; Sox18 Vehículo n = 8, E2 n = 8; Nrp1 Vehículo n = 7, E2 n = 6.) Los datos son media ± sem; Prueba t de dos colas múltiples no apareadas.

Datos fuente

a, Gráfico que muestra la concentración de E2 en suero en diferentes momentos durante el embarazo del ratón (n = 6 para dpc10.5, dpc17.5; n = 5 para Male, Virgin F, dpc5.5, dpp0, dpp7). Los datos son media ± sem; ANOVA de una vía con prueba de Tukey. b, Gráfico que muestra la concentración de E2 en suero en ratones P28 (n = 4 F, n = 4 M) y envejecidos (n = 8 F, n = 7 M). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. c, Imágenes confocales representativas con cuantificaciones de vasos sanguíneos tipo H (amarillo, Emcnhigh CD31high) (n = 5 para todas las condiciones), OBL (Osterix +, n = 5) y adipocitos BM (Perilipin +, n = 5) en Ratones operados de forma simulada y OVX tratados con vehículo y E2. La cuantificación por citometría de flujo de EC totales (CD31 + CD45-Ter119-) muestra la recuperación de BEC en huesos tratados con E2 (n = 5). Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes y la media ± sem para los datos de citometría de flujo. ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala de 50 μm. d, Las secciones de tejido óseo de los ratones tratados con Vehículo y Letrozol en P28 se inmunoteñeron con CD31 (verde) y Emcn (rojo) para identificar los vasos de tipo H. El gráfico muestra cuantificaciones de vasos sanguíneos tipo H (amarillos) (n = 4). La distribución de OBL y adipocitos de BM en estas secciones de hueso se obtuvieron mediante Osterix + (cian) y Perilipin (verde). Los gráficos muestran la cuantificación de OBL (n = 4) y adipocitos (n = 4) en ratones tratados con vehículo y letrozol. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala de 50 μm.

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a, Gráficos que indican los niveles relativos de ARNm de los receptores de estrógeno (Esr1, Esr2, Gper1) en BEC femenino y masculino en P28. (Esr1: n = 8 F, n = 7 M; Esr2, Gper1: n = 7) Los datos son media ± sem; Prueba t de dos colas para datos no apareados. b, Gráficos que muestran los niveles de transcritos de ER en BEC purificados de mutantes por deleción endoteliales Esr1, Esr2 o Gper1 y compañeros de camada de control (Control Esr1 n = 6 F, n = 6 M, Mutante n = 5 F, n = 5 M; Control Esr2 n = 5 F, n = 5 M, Mutante n = 6 F, n = 5 M; Control Gper1 n = 5 F, n = 6 M, Mutante n = 5 F, n = 6 M). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. c, Imágenes confocales representativas de mutantes con deleción endotelial de Esr1, Esr2 o Gper1 en comparación con controles Cre- de compañeros de camada, con cuantificaciones que muestran pérdida de OBL y aumento de adipocitos después de la deleción de Esr1 y Gper1 (Esr1:Osx-Control n = 10 F, n = 7 M, Mutante n = 9 F, n = 6 M; Esr1:Plin-Control n = 9 F, n = 8 M, Mutante n = 8 F, n = 8 M; Esr2:Osx-Control n = 5 F, n = 5 M, Mutante n = 6 F, n = 5 M; Esr2:Plin Control n = 5 F, n = 5 M, Mutante n = 6 F, n = 6 M; Gper1: Osx y Plin- Control n = 6 F, n = 7 M, Mutante n = 7 F, n = 7 M). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 40 μm.

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a, Análisis microCT representativo de mutantes con deleción endotelial de Esr1 en comparación con controles Cre- de compañeros de camada, con cuantificaciones que muestran la fracción de volumen del hueso trabecular (BV/TV), número, grosor y separación (n = 4), cuantificación de adipocitos (n = 4) y cuantificación del grosor y el área del hueso cortical (n = 4). Las imágenes confocales representativas muestran la distribución de osteoclastos en huesos de control y mutantes con cuantificación del número de osteoclastos (n = 6) y cobertura (n = 5). Los datos son la media ± sem para los resultados de micro-CT y ± sd para la cuantificación de imágenes; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 100 μm (microCT), 50 μm (confocal). b, Imágenes representativas de microCT de mutantes con deleción endotelial de Gper1 en comparación con controles Cre de compañeros de camada, con cuantificaciones que muestran la fracción de volumen del hueso trabecular (BV/TV), número, grosor y separación (n = 4), cuantificación de adipocitos (n = 4 ) y cuantificación de espesor y área de hueso cortical (n = 4). Las imágenes confocales representativas muestran la distribución de osteoclastos en huesos de control y mutantes con cuantificación del número de osteoclastos (n = 6) y cobertura (n = 5). Los datos son la media ± sem para los resultados de micro-CT y ± sd para la cuantificación de imágenes; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 100 μm (microCT), 50 μm (confocal).

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a, Gráfico de PCA de datos de RNAseq que muestra la agrupación de BEC macho y hembra purificados de ratones de 2 semanas, 12 semanas y 65 semanas de edad (n = 3). El mapa de calor de correlación de muestra del patrón de expresión génica muestra la agrupación de grupos de edad. b, Mapa de calor que muestra los genes asociados con el metabolismo de los ácidos grasos, que se expresan de manera diferencial en BEC de ratón envejecido entre machos y hembras. c, Imágenes confocales representativas que muestran tipos de células dentro del microambiente BM de mutantes Cpt1a con gráficos que muestran la cuantificación de células Osterix+ por mm de mp (Control n = 6 F, n = 7 M; Mutante n = 6 F, n = 6 M); Perilipina+ área por mm2 de área (Control n = 5 F, n = 6 M; Mutante n = 5 F, n = 5 M). Imágenes microCT representativas con cuantificación muestran un aumento en el volumen de adipocitos BM en mutantes Cpt1a (n = 4). Los datos son la media ± sd para la cuantificación de imágenes y la media ± sem para los datos de microCT; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 100 μm (microCT), 40 μm (confocal). d, Imágenes confocales representativas muestran células Osx+ y adipocitos Perilipin+ en control macho y ratones mutantes Cpt1aiΔEC tratados con E2. Los gráficos muestran cuantificaciones de células Osx+ por mm de mp (n = 5) y células Perilipin+ por mm2 (n = 5). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala de 50 μm.

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a, Las inmunotinciones muestran la expresión de FABP4 (verde) en los vasos sanguíneos (Emcn, rojo) del vehículo y la tibia tratada con E2 de ratones machos y hembras (n = 7). Barras de escala de 50 μm. b, Imágenes confocales representativas de la captación de lípidos de FA sintéticos conjugados con BODIPY en BEC tratados con vehículo y E2 (n = 4), con cuantificación por citometría de flujo que indica un aumento en la captación de lípidos con el tratamiento con E2. Los datos son media ± sem; Prueba t de dos colas para datos no apareados. Barras de escala 15 μm. c, Imágenes confocales representativas de los niveles de lípidos intracelulares en BEC tratados con vehículo y E2. El gráfico muestra la cuantificación por citometría de flujo de BEC que tienen niveles altos de LipidTOX (n = 4) en condiciones de vehículo y E2. Los datos son media ± sem; Prueba t de dos colas para datos no apareados. Barras de escala 15 μm. d, Imágenes confocales representativas de la captación de lípidos de ácidos grasos sintéticos conjugados con BODIPY en vehículos y BEC tratados con E2 tras el tratamiento con el inhibidor G36 de GPER1. La cuantificación muestra unidades de fluorescencia reducidas de BODIPY endotelial tras la inhibición de GPER1, en múltiples campos de visión de 63x (Vehículo n = 37, Vehículo+G36 n = 30; E2 n = 39, E2 + G36 n = 30). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 15 μm. e, Imágenes confocales representativas y cuantificación de los niveles de FABP4 endoteliales en ratones con deleciones del receptor de estrógeno Esr1 (Control n = 6 F, n = 6 M; Mutante n = 6 F, n = 6 M) y Gper1 (Control n = 6 F , n = 6 M, Mutante n = 6 F, n = 6 M). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Los niveles relativos de transcripción de Fabp4 también se cuantificaron en células endoteliales purificadas de mutantes endoteliales GPER1 (n = 4) y ESR1 (n = 4) en comparación con su control de camada. Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala de 50 μm.

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a, Imágenes confocales representativas de adipocitos BM (células Perilipin +) y enzimas lipolíticas (ATGL y HSL) en huesos mutantes Cpt1a y Gper1 y sus respectivos compañeros de camada. Barras de escala de 50 μm. Los gráficos muestran cuantificaciones de fluorescencia que indican una disminución de las enzimas lipolíticas (ATGL y HSL) en Cpt1a (ATGL: control n = 23 F, 15 M; mutante n = 23 F, 24 M. Control HSL n = 19 F, 36 M; mutante n = 42 F, 54 M), Gper1 (ATGL: Control n = 13 F, 12 M; Mutante n = 17 F, 21 M. HSL: Control n = 19 F, 50 M; Mutante n = 37 F, 49 M ) y Esr1 (ATGL: control n = 75 F, 72 M; mutante n = 63 F, 62 M. HSL: control n = 127 F, 79 M; mutante n = 106 F, 60 M) eliminación, por celda a través de múltiples 20x campos de visión. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. b, Gráficos que muestran los niveles de transcripción relativos de ARNm de Tnfa e Il6 en BEC aislados de ratones tratados con E2 (Vehículo n = 5 F, n = 5 M; E2 n = 5 F, n = 5 M) y deleción endotelial de Cpt1a y Gper1 mutantes (control n = 4 F, n = 4 M; mutante n = 4 F, n = 4 M). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. c, Gráfico que muestra niveles aumentados de TNFα (vehículo n = 12, E2 n = 12, E2 + G36 n = 6) e IL-6 (vehículo n = 12, E2 n = 12, E2 + G36 n = 6) cuantificados a partir de la celda sobrenadantes de cultivo de BEC tratados con vehículo, E2 y E2 + G36. Los datos son media ± sem; ANOVA de una vía con prueba de Tukey.

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a, Las imágenes confocales representativas muestran vasos tipo H (amarillo, Emcnhigh CD31high), OBL (Osterix+) y adipocitos BM (Perilipin+) en ratones envejecidos tratados con E2 (Vehículo n = 5 F, n = 5 M; E2 n = 5 F , n = 5 M). Barras de escala 40 μm. Los gráficos muestran la cuantificación de EC totales, vasos de tipo H, células Osx+ y Perilipin+ en huesos de ratones tratados con vehículo y E2. Los datos son media ± sem para datos de citometría de flujo y media ± sd para cuantificación de imágenes, ANOVA bidireccional con prueba de Tukey. b, Las imágenes confocales de secciones óseas inmunoteñidas para CD31 (verde), endomucina (rojo), actina de músculo liso alfa (αSMA, cian) muestran la distribución de arteriolas CD31 + Emcn- y TCV en ratones envejecidos tratados con Vehículo y E2. Los gráficos de cuantificación muestran un aumento en arteriolas y TCV (n = 5) después de la administración de E2 en ratones; Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 50 μm (arteriolas), 100 μm (TCV). c, Imágenes confocales representativas de los niveles de 4HNE en el endotelio óseo de ratones jóvenes (P28; n = 8) y de edad avanzada (>60 semanas; n = 4) tratados con vehículo y E2. Las imágenes muestran un recuadro que representa la expresión endotelial de 4HNE ilustrada por puntas de flecha. Barras de escala de 50 μm. d, modelo de menopausia VCD con recuadros que indican la expresión endotelial de 4HNE ilustrada por puntas de flecha (Vehículo n = 5; VCD n = 5). Los datos son media ± sd; Prueba t de dos colas para datos no apareados. Barras de escala de 50 μm.

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a, Imágenes confocales representativas de la expresión de FABP4 endotelial en ratones de edad avanzada (n = 5), que muestran un aumento después del tratamiento con E2. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala de 50 μm. b, Imágenes confocales representativas con cuantificación de los niveles de 4HNE en células endoteliales óseas tratadas con vehículo e inhibidor de FABP4 BMS 309403 en presencia de E2. La cuantificación mostró niveles elevados de 4HNE tras la inhibición de FABP4, que no se recuperó con el tratamiento con E2 (n = 6). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 15 μm. c, Imágenes confocales representativas de BEC tratadas con Control, Deferoxamine (DFM) o Artemisinin (Art). El gráfico muestra la cuantificación de la intensidad de fluorescencia de los niveles de 4HNE endotelial (Vehículo n = 24, E2 n = 26; Vehículo+DFM n = 26; E2 + DFM n = 27; Vehículo+Arte n = 21; E2 + Arte n = 23) Datos son la media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 15 μm. d, Imágenes confocales representativas con cuantificación de los niveles de 4HNE en el endotelio óseo del vehículo (n = 5 F, n = 5 M) y ratones tratados con DFM (n = 5 F, n = 6 M) en P28. Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala de 50 μm. e, Las imágenes confocales muestran vasos de tipo H, OBL y expresión de perilipina en microambientes de BM de ratones tratados con artemisinina (Art). Gráficos que muestran la cuantificación del volumen del vaso Tipo-H por campo de mp (Vehículo n = 4 F, n = 5 M; Artemisinina n = 4 F, n = 6 M), células Osterix+ por mm de mp (Vehículo n = 5 F, n = 7 M; artemisinina n = 5 F, n = 6 M), y Perilipin+ área por mp de área (Vehículo n = 5 F, n = 5 M; artemisinina n = 5 F, n = 6 M). Los datos son media ± sd; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala de 50 μm. f, Imágenes representativas renderizadas en 3D por microCT muestran huesos corticales de ratones macho de edad avanzada tratados con vehículo y liproxstatina-1 (Lip-1). Los gráficos muestran el grosor del hueso cortical (en mm) y el área del hueso cortical de ratones machos y hembras envejecidos tratados con vehículo (n = 4 F, 4 M) y liproxstatina-1 (n = 4 F, 4 M). Los datos son media ± sem; ANOVA de dos vías con prueba de Tukey. Barras de escala 100 μm.

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Figs suplementarias. 1 y 2

Datos de expresión génica que comparan BEC masculinos y femeninos en diferentes momentos

Primer secuencias utilizadas en el estudio

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Rodrigues, J., Wang, YF., Singh, A. et al. El estrógeno refuerza la integridad de los vasos sanguíneos en el hueso durante el embarazo y la menopausia. Nat Cardiovasc Res 1, 918–932 (2022). https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

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Recibido: 17 enero 2022

Aceptado: 02 septiembre 2022

Publicado: 12 de octubre de 2022

Fecha de emisión: octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

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