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Un esteroide masculino controla el comportamiento sexual femenino en el mosquito de la malaria
Nature, volumen 608, páginas 93–97 (2022)Citar este artículo
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Detalles de métricas
Se cree ampliamente que los insectos, a diferencia de los vertebrados, carecen de hormonas esteroides sexuales masculinas1. En el mosquito de la malaria Anopheles gambiae, el ecdisteroide 20-hidroxiecdisona (20E) parece haber evolucionado tanto para controlar el desarrollo de los huevos cuando lo sintetizan las hembras2 como para inducir la refractariedad del apareamiento cuando los machos lo transfieren sexualmente3. Debido a que el desarrollo de huevos y el apareamiento son rasgos reproductivos esenciales, comprender cómo las hembras Anopheles integran estas señales hormonales puede estimular el diseño de nuevos programas de control de la malaria. Aquí revelamos que estas funciones reproductivas están reguladas por distintos esteroides sexuales a través de una red sofisticada de enzimas que activan/desactivan ecdisteroides. Identificamos un ecdisteroide oxidado específico para hombres, 3-dehidro-20E (3D20E), que protege la paternidad al apagar la receptividad sexual femenina luego de su transferencia sexual y activación por desfosforilación. En particular, la transferencia 3D20E también induce la expresión de un gen reproductivo que preserva el desarrollo del huevo durante la infección por Plasmodium, lo que garantiza la aptitud de las hembras infectadas. El 20E derivado de hembras no desencadena la refractariedad sexual, sino que autoriza la oviposición en individuos apareados una vez que se reprime una quinasa inhibidora de 20E. La identificación de esta hormona esteroide de insecto específica para machos y sus funciones en la regulación de la receptividad sexual femenina, la fertilidad y las interacciones con los parásitos Plasmodium sugiere la posibilidad de reducir el éxito reproductivo de los mosquitos transmisores de malaria.
Los casos y las muertes por paludismo están aumentando una vez más4 debido a varios factores, incluida la resistencia generalizada a los insecticidas en los mosquitos Anopheles, que son los únicos vectores de los parásitos del paludismo humano. La biología de apareamiento de estos mosquitos es un objetivo particularmente atractivo para las nuevas intervenciones de control de la malaria porque las hembras se aparean solo una vez5; hacer que este único evento de apareamiento sea estéril tendría un enorme potencial para reducir las poblaciones de mosquitos de campo.
Las hembras pierden su receptividad sexual después de recibir altos títulos de hormonas esteroides de los machos. Los estudios han sugerido que el desencadenante de la refractariedad al apareamiento posterior es la 20-hidroxiecdisona (20E)3, una hormona esteroide más conocida como reguladora de los ciclos de muda durante las etapas larvales6. La capacidad de los machos para sintetizar y transferir 20E ha evolucionado específicamente en un subconjunto de especies de Anopheles del subgénero Cellia7, que puebla África y comprende los vectores de malaria más peligrosos, incluido Anopheles gambiae5. Esto es particularmente notable porque, en estas especies, las hembras también producen 20E después de cada comida de sangre, por lo que 20E impulsa los ciclos oogenéticos (revisado en la referencia 8). Sin embargo, la forma en que las hembras integran las señales que se originan en dos fuentes diferentes de ecdisteroides (transferidas por el macho e inducidas por la alimentación de sangre) sin afectar su propia capacidad para aparearse es poco conocida. De hecho, si la refractariedad sexual fuera provocada por el 20E producido por hembras, esto causaría esterilidad en individuos que se alimentan de sangre siendo vírgenes, lo cual es un comportamiento muy común entre estos mosquitos5.
Una posible explicación es que los machos de A. gambiae transfieran un ecdisteroide modificado específico de macho que activa cascadas de señalización en el tracto reproductivo femenino, lo que conduce a la refractariedad del apareamiento. Sin embargo, mientras que los vertebrados tienen múltiples clases de hormonas esteroides en gran medida dimórficas, como los estrógenos y los andrógenos (revisado en la referencia 9), los esteroides con sesgo masculino no se han identificado en los insectos, hasta donde sabemos.
Nos propusimos determinar la composición completa de las hormonas esteroides en las glándulas accesorias masculinas (MAG) de machos de A. gambiae sexualmente maduros, en busca de posibles esteroides modificados. Utilizando cromatografía líquida de alta resolución junto con espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) en lugar de los métodos menos específicos utilizados anteriormente7,10,11, detectamos ecdisona (E) y 20E en este tejido, lo que confirma los resultados anteriores. Sin embargo, las muestras estaban dominadas por un esteroide fosforilado oxidado consistente con la fórmula química 3-dehidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 (Fig. 1). Otras formas incluyeron 3-dehidro-20E (3D20E) y 20E-22-fosfato (20E22P). La intensidad de la señal de HPLC-MS/MS de 3D20E22P fue dos órdenes de magnitud mayor que la de su forma desfosforilada 3D20E y tres órdenes de magnitud mayor que la de E y 20E (Fig. 1). No se encontraron niveles detectables de 3D20E22P o 3D20E en hembras alimentadas con sangre, aunque se detectaron E y 20E (y niveles bajos de 20E22P) en el resto del cuerpo, como se esperaba11, y en el tracto reproductivo inferior (LRT; datos extendidos Fig. .1a). También perfilamos ecdisteroides en machos y hembras recién eclosionados (<1 día de edad) y detectamos 3D20E y 3D20E22P solo en los MAG; E, 20E y 20E22P estuvieron presentes en ambos sexos (Datos extendidos Fig. 1b). Estos datos demuestran que los machos adultos de A. gambiae producen altos títulos de hormonas modificadas en sus MAG que no son sintetizadas por las hembras.
Se diseccionaron MAG y LRT femeninos (que abarcan la aurícula, la espermateca y el parovario) de machos vírgenes de 4 días (4 días) y de hembras vírgenes y apareadas (a 0,5, 3 y 12 hpm). Los ecdisteroides en estos tejidos se analizaron mediante HPLC-MS/MS (media ± sem; prueba t no pareada, dos colas, tasa de falso descubrimiento (FDR) corregida; NS, no significativo; *P < 0,05, **P < 0,01 3D20E: 3 h frente a 0,5 h, P = 0,035; 12 h frente a 3 h, P = 0,0015; 12 h frente a 0,5 h, P = 0,030 3D20E22P: 3 h frente a 0,5 h, P = 0,25; 12 h frente a 3 h , P = 0,0032; 12 h versus 0,5 h, P = 0,015). Se agruparon los datos de tres réplicas biológicas. El área del pico se calculó para cada ecdisteroide de interés y se normalizó por el número de mosquitos. Los ecdisteroides se indican por color de la siguiente manera: E, verde; 20E, naranja; 20E22P, morado; 3D20E, azul; 3D20E22P, rosa. Los recuadros aumentan la escala en el eje y para mostrar los niveles más bajos de ecdisteroides.
Datos fuente
Para investigar si 3D20E22P y 3D20E se transfieren durante el apareamiento, diseccionamos el LRT femenino en diferentes momentos después del apareamiento. Mientras que no se identificó ecdisteroide en vírgenes, observamos una gran cantidad de 3D20E22P en el LRT inmediatamente después de la cópula (0,5 h después del apareamiento, hpm), que disminuyó con el tiempo en paralelo con un aumento significativo en los niveles de 3D20E (Fig. 1). Usando 3D20E sintetizado químicamente como estándar, determinamos que los niveles de esta hormona esteroide en LRT acoplada eran al menos 100 veces más altos que los de 20E (Tabla 1 de datos ampliados). 3D20E22P es, por lo tanto, el principal ecdisteroide masculino transferido a la hembra LRT durante el apareamiento, y su forma desfosforilada 3D20E se vuelve muy abundante poco después del apareamiento. Esto sugiere un papel destacado de este último ecdiesteroide en la biología post-apareamiento de las hembras.
Utilizando una canalización de bioinformática personalizada después de la generación de nuevos conjuntos de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), buscamos genes que codifican quinasas de ecdisteroide modificadoras de 20E (EcK), ecdisona oxidasas (EO) y fosfatasas de fosfato de ecdisteroide ( EPP) expresado en tejidos reproductivos. Identificamos un gen EPP candidato y dos genes EcK potenciales (EcK1 y EcK2), pero no pudimos encontrar un buen gen EO candidato. En particular, el gen EPP único se expresó en niveles altos (percentil 98.9) en A. gambiae MAG pero no en el LRT femenino (Fig. 2b), contrariamente a nuestras expectativas dado que la desfosforilación de 3D20E22P ocurre en este tejido femenino. Por lo tanto, consideramos que el EPP masculino puede transferirse durante la cópula. De hecho, identificamos esta enzima por MS en el atrio de las hembras después del apareamiento usando el etiquetado de isótopos estables in vivo para enmascarar las proteínas femeninas (Fig. 2c y Tabla complementaria 1). La presencia de EPP en los MAG y en LRT hembra apareada (pero no virgen) también se confirmó usando un anticuerpo específico (Fig. 2d).
a, La canalización bioinformática personalizada que se utiliza para buscar genes que codifican EcK, EO y EPP en los tejidos reproductivos de cada sexo. Los números junto a las flechas indican el número de candidatos masculinos y femeninos en cada paso. Este análisis identificó un gen EPP (EPP) y un gen EcK (EcK1) expresados en machos, y un gen EcK (EcK2) expresado en ambos sexos pero no produjo un gen EO candidato. b, Mapa de calor que compara la expresión de genes candidatos en tejidos de A. gambiae y Anopheles albimanus vírgenes (V) y apareados (M). Spca, espermateca; MAG, glándulas accesorias masculinas; cuerpo, el resto del cuerpo incluyendo el tórax, alas, patas, grasa corporal y tripas en ambos sexos y ovarios en las hembras. EcK2 se expresó en gran medida tanto en las MAG como en las aurículas de A. gambiae, mientras que EPP se encontró solo en las MAG. c, Análisis proteómico del eyaculoma masculino transferido a la aurícula femenina a las 3, 12 y 24 hpm, mostrando las 67 proteínas más abundantes. Las hembras se criaron con alimentos que contenían 15N para etiquetar (y enmascarar) todas las proteínas. Los machos sin etiquetar se aparearon con hembras etiquetadas, y las LRT femeninas se diseccionaron a las 3, 12 y 24 hpm para el análisis proteómico (consulte la Tabla complementaria 1 para obtener una lista completa de las proteínas del eyáculo). Recuadro, EPP, Eck1 y EcK2 detectados en los MAG de machos vírgenes mediante análisis proteómico de estos tejidos. d, EPP detectado por western blot en los MAG y LRT de hembras apareadas, pero no en hembras vírgenes ni en el resto del cuerpo de machos o hembras. La membrana se sondeó simultáneamente con anticuerpos anti-actina (control de carga) y anti-EPP. Todos los varones eran vírgenes. Para obtener datos de la fuente de gel, consulte la Fig. 1 complementaria. La transferencia Western se realizó dos veces con resultados similares.
Datos fuente
La actividad de fosfatasa de fosfato de ecdisteroide de EPP se validó después de la incubación con 3D20E22P aislado de los MAG por HPLC-MS/MS (datos extendidos, Fig. 2a). Además, cuando silenciamos EPP por interferencia mediada por ARN (ARNi), detectamos una fuerte disminución en la actividad de la fosfatasa en estos tejidos reproductivos masculinos (Fig. 3a), y las hembras apareadas con machos silenciados por EPP mostraron una proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilado. (Fig. 3b) a pesar del silenciamiento génico parcial (Datos extendidos Fig. 2b, c). Por el contrario, no detectamos un cambio significativo en la relación 20E22P/20E en los mismos mosquitos, lo que posiblemente sugiera especificidad de esta enzima para 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Disminución de la actividad de la fosfatasa en los MAG provocada por el silenciamiento de EPP usando el control de ARN de EPP de doble cadena (dsEPP) o ARN de GFP de doble cadena (dsGFP). Se utilizó un grupo de 20 MAG en cada réplica (P = 0,0046, prueba t pareada, bilateral), indicado por puntos separados. b, las hembras apareadas con machos silenciados con EPP tienen una proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilado a 3 hpm (P = 0,0043, prueba t no pareada, bilateral), mientras que los niveles de 20E no se ven afectados (P = 0,063, prueba t no pareada, dos caras). Los datos se presentan como media ± sem, derivados de tres grupos de 13, 16 y 19 hembras cada uno. c, las hembras apareadas con machos silenciados por EPP tienen una tasa significativamente mayor de re-apareamiento (P = 0,0002, prueba exacta de Fisher, bilateral). Las hembras fueron primero apareadas a la fuerza para asegurar su estado de apareamiento; 2 días más tarde, fueron expuestos a machos adicionales que portaban esperma transgénico para evaluar las tasas de apareamiento mediante la detección cuantitativa por PCR del transgén. d, las hembras alimentadas con sangre apareadas con machos silenciados por EPP tienen una disminución significativa en la fertilidad (P < 0,0001; prueba de Mann-Whitney, dos caras) y una ligera disminución en el número de huevos (P = 0,088, prueba de Mann-Whitney, dos caras). lateral), mientras que la tasa de oviposición no se ve afectada (P = 0,94, prueba exacta de Fisher, bilateral). En todos los paneles, n indica el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes. NS, no significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Datos fuente
Luego evaluamos si la desfosforilación de ecdisteroides es importante para inducir la refractariedad de las hembras al apareamiento. Sorprendentemente, las hembras apareadas con machos sin EPP se volvieron a aparear con frecuencias sustancialmente más altas (44,9 %) que las hembras de control (10,4 %) cuando se expusieron a machos adicionales (transgénicos) (Fig. 3c). También observamos una disminución significativa en la fertilidad (Fig. 3d, izquierda) y una disminución marginal en el número de huevos puestos por estas hembras (Fig. 3d, centro), mientras que el porcentaje de hembras que ovipositan (otra respuesta provocada en las hembras por el apareamiento ) no se vio afectado (Fig. 3d, derecha). Dada la especificidad observada de EPP para 3D20E22P, estos resultados sugieren que la activación de 3D20E por parte de EPP transferida durante el apareamiento puede tener un papel destacado en la desactivación de la receptividad de la hembra para una mayor cópula, un comportamiento que se ha atribuido previamente a la transferencia sexual de 20E. Por lo tanto, esta hormona específica masculina también afecta fuertemente la fertilidad femenina.
A continuación, comparamos la actividad de 20E y 3D20E en experimentos de inyección en hembras vírgenes sexualmente maduras, utilizando 3D20E sintetizado químicamente (Fig. 4a-c) y 20E comercialmente disponible. Observamos que 3D20E fue significativamente más efectivo que 20E para desactivar la susceptibilidad de la hembra al apareamiento en dos concentraciones (Fig. 4d). En particular, 24 h después de las inyecciones a la concentración más alta, la mitad del nivel fisiológico de 3D20E en el LRT (1066 pg después de las inyecciones frente a 2022 pg después del apareamiento) indujo una mayor proporción de hembras refractarias que 20 veces el nivel fisiológico de 20E (361 pg después de las inyecciones frente a 18 pg después del apareamiento (Tabla de datos ampliados 1). Este resultado está de acuerdo con la noción de que la transferencia sexual de 20E no induce refractariedad al apareamiento y además apunta a 3D20E como el factor principal que asegura la paternidad. 3D20E también mostró una actividad significativamente más alta que 20E en los ensayos de oviposición en hembras vírgenes (Fig. 4e), lo que sugiere que las tasas de oviposición normales que observamos después del silenciamiento parcial de EPP se debieron a factores femeninos que todavía se desencadenaron por el apareamiento en presencia de actividad residual de 3D20E.
(a,b) 3D20E sintetizado químicamente a partir de 20E (a) con niveles muy altos de conversión/eficiencia (datos presentados como media ± sem, derivados de tres reacciones de síntesis independientes) (b). c, los espectros de masas (mitad inferior) coincidían perfectamente con los de los ecdisteroides encontrados en el LRT hembra apareado (mitad superior). d, la inyección de 0,63 µg o 0,21 µg de 3D20E indujo una refractariedad significativamente mayor al apareamiento que 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; pruebas exactas de Fisher, bilateral) y controles de etanol al 10 % (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; pruebas exactas de Fisher, bilateral), mientras que 20E fue significativamente mayor que los controles solo con la dosis más alta (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; pruebas exactas de Fisher , dos caras). e, las inyecciones de 3D20E indujeron tasas de oviposición significativamente más altas que los controles de etanol al 10 % en hembras vírgenes (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; prueba exacta de Fisher, bilateral), mientras que 20E fue significativa en comparación con los controles solo en la dosis más alta (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; pruebas exactas de Fisher, bilateral). 3D20E indujo tasas de oviposición significativamente más altas que 20E a dosis más altas (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; pruebas exactas de Fisher, bilateral). En todos los paneles, n indica el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes. NS, no significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Se agruparon los datos de tres réplicas.
Datos fuente
En estudios previos, determinamos que la transferencia sexual de hormonas esteroides induce la expresión de MISO (estimulador de la oogénesis inducido por el apareamiento11), un gen reproductivo femenino que protege a las hembras de A. gambiae de los costos de acondicionamiento físico que de otro modo infligiría la infección con Plasmodium falciparum13, el más letal parásito de la malaria humana. Dada la importancia de MISO para la aptitud reproductiva de Anopheles en regiones endémicas de malaria, decidimos determinar qué hormona, 3D20E o 20E, desencadena la expresión de este gen. Descubrimos que mientras que las inyecciones de 20E inducían específicamente o inducían más potentemente algunos receptores de hormonas nucleares (HR) como HR3 y HR4 y objetivos de esteroides posteriores canónicos como el gen de vitelogénesis Vg14,15,16, MISO fue inducido más fuertemente por 3D20E (Datos extendidos). Fig. 3). Por lo tanto, la transferencia sexual de esta hormona esteroide masculina parece inducir mecanismos que protegen a las hembras de los costos que de otro modo infligiría la infección parasitaria. Además, 3D20E afectó de manera diferencial a dos isoformas del receptor EcR, induciendo EcR-A y reprimiendo EcR-B, y desencadenó con más fuerza otros genes inducidos por el apareamiento, incluido HPX15, que afecta la fertilidad femenina17. Esto podría explicar la infertilidad significativa observada en las hembras apareadas con machos silenciados por EPP (Datos extendidos Fig. 3). Estos datos sugieren la existencia de vías aguas abajo activadas preferentemente por los dos ecdisteroides que pueden ser la base específica de funciones específicas del sexo.
A continuación, probamos la función de los dos genes EcK identificados en nuestra tubería bioinformática. El silenciamiento de EcK1 o EcK2 indujo una mortalidad significativa en los machos (Datos ampliados, Fig. 4a), lo que demuestra que la fosforilación de ecdisteroides y, por lo tanto, la desactivación12, es importante para la supervivencia. Debido a que EcK2 se expresa en niveles más altos que EcK1 y se detectó en MAG por proteómica (Fig. 2b, c y Tabla complementaria 2), validamos su actividad de quinasa de ecdisteroide incubándola con 20E, lo que resultó en 20E22P fosforilado (Fig. 4b). Cuando se usó 3D20E como sustrato, no pudimos detectar el producto de fosforilación 3D20E22P (datos extendidos, figura 4c), lo que indica que 20E en lugar de 3D20E puede ser un objetivo preferido de EcK2.
Según nuestro análisis de RNA-seq, EcK2 también se expresa mucho en el LRT de hembras vírgenes, donde se apaga después del apareamiento (Fig. 2b). Confirmamos estos datos y determinamos que la expresión de EcK2 no se ve afectada por la alimentación con sangre (Datos extendidos Fig. 5a). Ampliando nuestros experimentos iniciales de EM, determinamos que el pico de 20E22P reflejaba de cerca el de 20E (22 a 26 h después de una comida de sangre; Datos extendidos, Fig. 5b). El silenciamiento de EcK2 en hembras vírgenes causó un aumento de 3 veces en la proporción relativa de 20E a 20E22P 26 h después de una comida de sangre (Datos extendidos Figs. 2c y 5c), lo que confirma que EcK2 también fosforila 20E en hembras. En particular, las vírgenes empobrecidas en EcK2 mantuvieron una receptividad sexual completa (Datos extendidos Fig. 5d, e), lo que demuestra aún más que el 20E producido por hembras no induce la refractariedad de apareamiento. Sin embargo, estas hembras mostraron un aumento significativo en las tasas de oviposición en relación con los controles, con más del 30 % de las vírgenes poniendo huevos (Datos ampliados, Fig. 5f). La oviposición no se produjo si las inyecciones de ARN Eck2 de doble cadena (dsEcK2) se realizaron después de la alimentación con sangre, cuando el pico de 20E inducido por la ingestión de sangre ya había disminuido. En general, estos resultados respaldan un modelo en el que el 20E producido después de la alimentación con sangre puede inducir la oviposición, pero solo cuando los bloqueos de la oviposición (EcK2 y posiblemente otros factores) se desactivan mediante el apareamiento. Ni las inyecciones de 20E ni las de 3D20E suprimieron la expresión de EcK2 en vírgenes (datos extendidos, figura 5g), lo que indica que otros factores median en la represión de esta quinasa. Los niveles de 20E después de la alimentación con sangre, sin embargo, no son suficientes para inducir la refractariedad al apareamiento, que en cambio es desencadenado de manera eficiente por altos títulos de 3D20E transferido sexualmente.
Nuestros resultados proporcionan una visión crítica de los mecanismos que regulan el éxito reproductivo de A. gambiae. Surge un modelo en el que los machos han evolucionado para sintetizar altos títulos de 3D20E, un ecdiesteroide modificado específico para machos que garantiza la paternidad al insensibilizar específicamente a las hembras para un mayor apareamiento. Paralelamente, estos vectores de malaria también han desarrollado un sistema eficiente para activar 3D20E en hembras basado en la transferencia sexual de EPP específico de macho. Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de un sistema de hormonas esteroides predominantemente masculinas y femeninas que ejercen funciones distintas y clave en los insectos. Se ha postulado la existencia de funciones ecdiesteroides específicas de los machos, pero no se ha demostrado definitivamente. Por ejemplo, una hipótesis ampliamente refutada18 es que tales funciones pueden ser realizadas por el precursor 20E E1. Está bien establecido que, en Drosophila, la monandria se desencadena por la transferencia sexual de pequeños péptidos sexuales19,20 que interactúan con las neuronas que inervan el tracto reproductivo femenino a través de receptores de péptidos sexuales específicos21,22. Se necesita más trabajo para identificar las cascadas de señalización aguas abajo controladas por 3D20E en hembras de A. gambiae y para determinar si estas cascadas pueden conservarse entre mosquitos y moscas de la fruta.
Dado el importante papel de 3D20E para la fertilidad y el comportamiento de las hembras determinado en nuestro estudio, las vías que conducen a la síntesis y activación de 3D20E brindan oportunidades novedosas para futuras estrategias de control de mosquitos, como generar machos estériles competitivos para liberaciones en el campo en estrategias de técnicas de insectos estériles23 o imitar 3D20E función en mujeres vírgenes. Una función específica masculina para 3D20E puede haber evolucionado cuando A. gambiae y otras especies de Cellia adquirieron la capacidad de coagular su líquido seminal en un tapón de apareamiento7 porque esto permitió la transferencia efectiva de grandes cantidades de hormonas y enzimas activadoras de hormonas. A su vez, la evolución de 3D20E para hacer cumplir la monandria también equipó a las hembras con mecanismos (a través de la alta expresión de MISO) que favorecían su aptitud reproductiva en áreas de alta endemicidad de malaria, lo que indirectamente promueve la propagación de parásitos Plasmodium. Dado que se ha demostrado que el 20E femenino afecta profundamente la supervivencia y el crecimiento de P. falciparum en las hembras de Anopheles24, las vías de las hormonas esteroides masculinas y femeninas ahora son facetas clave en las interacciones mosquito-parásito.
La cepa A. gambiae G3 se crió en condiciones estándar de insectario (26–28 °C, 65–80 % de humedad relativa, fotoperíodo de 12:12 h de luz/oscuridad). Las larvas se alimentaron con alimento en polvo para peces (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets y Tetra Pond Sticks en una proporción de 7:7:2). Los mosquitos adultos fueron alimentados ad libitum con solución de glucosa al 10% y semanalmente con sangre humana (Research Blood Components). Los mosquitos vírgenes se obtuvieron separando los sexos en la etapa de pupa después del examen microscópico de la terminalia. Previamente se han descrito machos portadores del transgén DsRed25.
Los experimentos de apareamiento forzado se realizaron de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente13. Para el apareamiento natural, las hembras vírgenes de 4 días de edad se mantuvieron durante dos noches con machos vírgenes sexualmente maduros en una proporción de 1:3. Para los experimentos que utilizaron machos inyectados con dsEPP, el enjaulamiento compartido coincidió con los días 3 a 4 después de la inyección, cuando la actividad de la fosfatasa se silenció al máximo (Datos extendidos, Fig. 2b).
Los tejidos de mosquitos, los cadáveres restantes (resto del cuerpo) o los cuerpos enteros se diseccionaron en metanol al 100 % y se homogeneizaron con un batidor de perlas (perlas de vidrio de 2 mm, 2400 rpm, 90 s). El número de tejidos y el volumen de metanol fueron los siguientes: resto del cuerpo, 50 en 1000 µl; MAG, 50–100 en 80 µl; hembra LRT, 25–50 en 80 µl. La extracción con metanol se realizó una segunda vez en el sedimento usando el mismo volumen de metanol. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación. El metanol de dos extracciones se combinó y se secó bajo flujo de nitrógeno y se resuspendió en los siguientes volúmenes de metanol al 80% en agua: resto del cuerpo, 50 µl; MAG y LRT hembra, 30 µl.
Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas (ID-X, Thermo Fisher) acoplado a un instrumento LC (Vanquish, Thermo Fisher). Se inyectaron cinco microlitros de muestra en una columna de 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantenida a 25 °C. Las fases móviles para la CL fueron A (agua, ácido fórmico al 0,1 %) y B (acetonitrilo, ácido fórmico al 0,1 %). El gradiente de LC fue el siguiente: 1 min al 5 % de B seguido de un aumento al 100 % de B en 11 min. Después de 8 min al 100 %, la columna se volvió a equilibrar al 5 % de B durante 4 min. El caudal fue de 0,3 ml min−1. La ionización en la fuente MS se realizó mediante ionización por electropulverización calentada en modos positivo y negativo.
El espectrómetro de masas midió datos en modo MS completo con una resolución de 60 000 en un rango m/z de 350 a 680. Los datos MS/MS se adquirieron en [M + H]+ (todos los objetivos), [M − H2O + H] + (todos los objetivos) y [M − H]− (objetivos fosforilados). Los datos de MS/MS se usaron para confirmar la naturaleza ecdiesteroide de los objetivos para los que no había estándares disponibles. Para identificar ecdisteroides no dirigidos, se analizaron los datos de MS/MS para todos los picos de HPLC de >15 % de abundancia relativa. La cuantificación se realizó utilizando curvas estándar creadas a partir de estándares puros (20E, 3D20E) para calcular cantidades absolutas o diluciones de una muestra específica (todos los demás objetivos) para calcular su equivalencia con la cantidad encontrada en un macho. Para 3D20E, la cuantificación se realizó con la suma de los siguientes aductos: [M + TFA]−, [M + COOH]−, [M + Na]+, [M + Cl]−, [M + NO3]−. Los datos se extrajeron y cuantificaron utilizando Tracefinder (versión 4.1). Los datos de MS/MS se analizaron utilizando Xcalibur (versión 4.4). Los espectros de MS de E, 20E y 3D20E se compararon con los estándares respectivos. 3D20E22P se analizó por derivatización con el reactivo de Girard. 20E22P se analizó por relación m/z.
3D20E22P se purificó a partir de MAG. La purificación se realizó a escala analítica en las mismas condiciones de LC que para el análisis HPLC-MS/MS utilizando un instrumento de cromatografía líquida de ultra rendimiento (Acquity, Waters) acoplado con un detector basado en masa cuadrupolo (QDa, Acquity, Waters). La recolección de fracciones se activó cuando se detectó la m/z correspondiente a 3D20E22P en el mismo tiempo de retención que el identificado previamente. Luego, la pureza de los compuestos extraídos se verificó mediante HPLC-MS/MS como se describe anteriormente.
El ARN total se extrajo con reactivo TRI (Thermo Fisher) de grupos de 10 a 12 tejidos reproductivos o del resto del cuerpo (sin cabeza) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se trató con TURBO DNase (Thermo Fisher). El ADNc se sintetizó utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR; tabla de datos ampliados 2) se publicaron previamente24 o se diseñaron usando Primer-BLAST26 con preferencia por productos de 70 a 150 pb de tamaño y por cebadores que abarcan uniones exón-exón o pares de cebadores en exones separados. Las muestras de ADNc de tres a cuatro réplicas biológicas se diluyeron cuatro veces en agua para RT-qPCR. La cuantificación se realizó en reacciones duplicadas de 15 µl que contenían 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), cebadores y 5 µl de ADNc diluido. Las reacciones se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) y los datos se recopilaron y analizaron mediante Design and Analysis (versión 2.4.3). Las cantidades relativas se normalizaron frente al gen ribosomal RpL19 (AGAP004422), cuya expresión no cambia significativamente con la alimentación de sangre27 o el apareamiento3, como se confirmó en este estudio.
La calidad del ARN se comprobó con un bioanalizador Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Las bibliotecas de extremos emparejados de Illumina se prepararon y ejecutaron en el Instituto Broad del MIT y Harvard. Las lecturas de secuenciación se alinearon con el genoma de A. gambiae (cepa PEST, versión 4.12) utilizando HISAT2 (versión 2.0.5) con los parámetros predeterminados. Las lecturas con puntajes de calidad de mapeo (MAPQ) <30 se eliminaron usando Samtools (versión 1.3.1). El número de lecturas asignadas a los genes se contó utilizando htseq-count (versión 0.9.1) con los parámetros predeterminados. El cálculo de los recuentos de lectura normalizados y el análisis de la expresión génica diferencial se realizó utilizando el paquete DESeq2 (versión 1.28.1) en R (versión 4.0.3).
Los candidatos a genes modificadores de ecdisteroides se identificaron buscando primero en el genoma de A. gambiae con el algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) usando el valor predeterminado parámetros con las siguientes secuencias de proteínas de consulta: EcK de Bombyx mori (acceso NP_001038956.1), Musca domestica (accesos XP_005182020.1, XP_005175332.1 y XP_011294434.1) y Microplitis demolitor (accesos XP_008552646.1 y XP_00855264 5.1); EPP de B. mori (acceso NP_001036900), Drosophila melanogaster (acceso NP_651202), Apis mellifera (acceso XP_394838) y Acyrthosiphon pisum (acceso: XP_001947166); y EO de B. mori (accesos NP_001177919.1 y NP_001243996.1) y D. melanogaster (acceso NP_572986.1) (paso 1). A continuación, los genes hit se filtraron sobre la base de una alta expresión de ARNm (> 100 fragmentos por kilobase de exón por millón de lecturas mapeadas (FPKM) o > percentil 85) en tejidos reproductivos (LRT o MAG femeninos) de A. gambiae (paso 2) . Para mejorar la especificidad, seleccionamos enzimas candidatas que también se expresan en los tejidos reproductivos de A. albimanus, una especie anofelina que no sintetiza ni transfiere ecdisteroides durante el apareamiento7; Los genes candidatos se filtraron en función de la baja expresión (<100 FPKM o Modificamos un método descrito previamente28,29,30 para lograr el etiquetado isotópico de todo el organismo. En resumen, Saccharomyces cerevisiae tipo II de tipo salvaje (YSC2, Sigma) se cultivó en un medio que contenía (peso/vol) glucosa al 2 % (G7528, Sigma), base nitrogenada de levadura al 1,7 % sin aminoácidos y sulfato de amonio (BD Difco, DF0335 ) y sulfato de amonio 15N al 5 % (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) como única fuente de nitrógeno. La levadura se recuperó por centrifugación y se alimentó ad libitum a las larvas de mosquito hasta la pupa. Se complementó con alimento en polvo para peces (0,5 mg por 300 larvas) para evitar la muerte en el cuarto estadio. Luego, solo se usaron hembras en experimentos de apareamiento con machos no marcados para analizar el proteoma masculino transferido durante la cópula. Las hembras vírgenes marcadas con 15N de 4 a 6 días de edad fueron apareadas a la fuerza con machos vírgenes sin marcar de la misma edad. El apareamiento exitoso se verificó mediante la detección de un tapón de apareamiento bajo un microscopio de epifluorescencia. A las 3, 12 y 24 hpm, las aurículas de 45–55 hembras apareadas se diseccionaron en 50 µl de tampón de bicarbonato de amonio (pH 7,8) y se homogeneizaron con un mortero. El homogeneizado se centrifugó y el sobrenadante se combinó con 50 µl de RapiGest al 0,1 % (186001860, Waters) en bicarbonato de amonio 50 mM. El sobrenadante y el sedimento de cada muestra se congelaron instantáneamente en hielo seco y se enviaron durante la noche al MacCoss Lab de la Universidad de Washington, donde se completó la preparación de la muestra para LC-MS/MS. Los sedimentos se resuspendieron en 50 µl de RapiGest al 0,1 % en bicarbonato de amonio 50 mM y se sonicaron en un baño de agua. La concentración de proteína se midió tanto para los sedimentos como para los sobrenadantes mediante un ensayo BCA, y las muestras se redujeron con ditiotreiotol 5 mM (DTT; Sigma) alquilado con yodoacetamida 15 mM (Sigma) y digerido con tripsina durante 1 h a 37 °C (1:50 relación tripsina:sustrato). RapiGest se escindió con la adición de HCl 200 mM seguido de 45 min de incubación a 37 °C y centrifugación a 14 000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar los residuos. Las muestras se limpiaron mediante extracción en fase sólida de modo dual (cartuchos Oasis MCX, Waters) y se resuspendieron en ácido fórmico al 0,1 % a una concentración de proteína final de 0,33 µg µl−1. Los proteomas MAG no marcados se analizaron de manera similar a partir de machos vírgenes. Se analizaron dos réplicas analíticas para cada muestra. A continuación, se analizó 1 µg de cada digerido de muestra utilizando una columna de 75 µm de sílice fundida de 25 cm y una trampa de frita Kasil1 (PQ) de sílice fundida de 4 cm cargada con resina de fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) con una CL de 180 min. –MS/MS ejecutado en un espectrómetro de masas Q-Exactive HF (Thermo Fisher) acoplado con un sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). Los datos de adquisición dependientes de los datos generados de cada ejecución se convirtieron al formato mzML usando Proteowizard (versión 3.0.20287) y se buscaron usando Comet31 (versión 3.2) contra una base de datos FASTA que contiene secuencias de proteínas de A. gambiae (VectorBase versión 54), Anopheles coluzzi Mali-NIH (versión 54 de VectorBase), S. cerevisiae (Uniprot, marzo de 2021), traducciones de tres fotogramas de A. gambiae RNA-seq y contaminantes humanos conocidos. Los FDR de coincidencia de espectro de péptidos se determinaron utilizando Percolator32 (versión 3.05) en un umbral de 0.01, y los péptidos se ensamblaron en identificaciones de proteínas utilizando parsimonia de proteínas en Limelight33 (versión 2.2.0). La abundancia relativa de proteínas se estimó usando un factor de abundancia espectral normalizado (NSAF) calculado para cada proteína dentro de cada corrida como se describió previamente28. Se promedió el NSAF relativo a cada proteína entre muestras de dos réplicas biológicas diferentes. El marcaje con 15N enmascaró con éxito el proteoma femenino, aunque se pudo detectar un pequeño número de proteínas no marcadas a partir de vírgenes marcadas. Documentamos la detección en cantidades reducidas (1–5 espectros) de proteínas masculinas en muestras vírgenes femeninas solo en ejecuciones técnicas en las que las muestras vírgenes se analizaron después de muestras masculinas/apareadas, como resultado del "remanente" de HPLC. Las proteínas que se encontraron ocasionalmente como "contaminantes" de las vírgenes etiquetadas se enumeran en la Tabla complementaria 1. Se identificaron dos péptidos antigénicos, QTTDRVAPAPDQQQ (dentro de la isoforma PA) y MESDGTTPSGDSEQ (dentro de las dos isoformas PA y PB), de la secuencia de la proteína EPP sobre la base de las predicciones de antigenicidad, probabilidad de exposición superficial e hidrofilia proporcionadas como parte del servicio de anticuerpos personalizado. en Genscript. Los dos péptidos se agruparon y luego se conjugaron con la proteína transportadora KLH y se inyectaron en conejos de Nueva Zelanda. Los conejos se sacrificaron después de la cuarta inyección y se aisló la IgG total con purificación por afinidad. Se usó IgG del conejo más específico de EPP en transferencia Western adicional. Para el Western Blot, se diseccionaron MAG (n = 10, donde n indica el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes) y LRT hembras (n = 30) de machos vírgenes de 4 días y hembras vírgenes o apareadas a la fuerza (<10 min). después del apareamiento), respectivamente, en tampón de extracción de proteínas (Tris 50 mM, pH 8,0; NP-40 al 1 %; desoxicolato de sodio al 0,25 %; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; mezcla inhibidora de proteasa 1x (Roche)). Las muestras se homogeneizaron inmediatamente después de la disección con un batidor de perlas (perlas de vidrio de 2 mm, 2400 rpm, 90 s). Los residuos insolubles se eliminaron por centrifugación a 20.000 ga 4 °C. La proteína se cuantificó mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad). Luego, 20 µg de proteína MAG, 40 µg de proteína LRT y 20 µg del resto de la proteína corporal se desnaturalizaron y separaron con Bis-Tris NuPAGE al 10 % utilizando tampón MOPS. La proteína se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno utilizando un sistema de transferencia iBlot2 (Thermo Fisher). Las membranas se lavaron dos veces en PBS-T 1x (Tween-20 al 0,1 % en PBS) y luego se bloquearon durante 1 hora a 22 °C en tampón de bloqueo Odyssey (Li-Cor). Las membranas se incubaron con el anticuerpo primario policlonal anti-EPP de conejo personalizado (1:700 en tampón de bloqueo) y el anticuerpo primario monoclonal anti-actina de rata MAC237 (Abcam; 1:4000) con agitación durante la noche a 4 °C. Las membranas se lavaron con PBS-T y luego se incubaron con anticuerpos secundarios (burro anti-conejo 800CW y cabra anti-rata 680LT (Li-Cor), ambos a 1:20.000) en tampón de bloqueo con SDS al 0,01 % y Tween al 0,2 %. -20 durante 1 h a 22 °C. Las membranas se lavaron con PBS-T y se tomaron imágenes con un escáner Odyssey CLx. Las imágenes fueron recopiladas y procesadas en Image Studio (versión 5.2). No se detectó ninguna banda específica correspondiente a la isoforma EPP-RA (82 kDa). Las regiones codificantes de EPP (como la isoforma AGAP002463-RB que contiene el dominio de histidina fosfatasa, NCBI Conservated Domain Search34) y EcK2 (AGAP002181) se clonaron en el plásmido pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); los cebadores se enumeran en la Tabla 2 de datos ampliados. Se insertaron ocho conectores GS4 (en tándem) antes de la etiqueta C-terminal 6xHis en la construcción pET-21a(+)-EcK2. Las proteínas recombinantes se produjeron con reacciones de síntesis de proteínas de Escherichia coli sin células NEBExpress (New England BioLabs). Las proteínas recombinantes se purificaron con columnas de centrifugado NEBExpress Ni (New England BioLabs). La proteína de control de la dihidrofolato reductasa (DHFR) se produjo utilizando la plantilla de ADN del kit de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress. Las proteínas se almacenaron en glicerol al 50 % en PBS a -20 °C durante un máximo de 3 meses. La actividad de fosfatasa de EPP y extractos de tejido se midió utilizando fosfato de 4-nitrofenilo (pNPP; Sigma-Aldrich). El tampón de reacción contenía Tris 25 mM, ácido acético 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM y DTT 1 mM. Los tejidos se homogeneizaron en tampón de reacción y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación. La reacción se inició añadiendo enzima o extracto de tejido al tampón de reacción que contenía 2,5 mg ml−1 de pNPP. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad y la cantidad de pNP convertida a partir de pNPP se cuantificó midiendo la absorción a 405 nm en varios tiempos. Para la actividad de EcK in vitro, las proteínas se incubaron con 0,2 mg de 20E o 3D20E en 200 µl de tampón (pH 7,5) que contenía HEPES-NaOH 10 mM, BSA al 0,1 %, ATP 2 mM y MgCl2 10 mM a 27 °C durante 2 h . La reacción se terminó agregando 800 µl de metanol y luego se enfrió durante 1 h a -20 °C seguido de centrifugación a 20 000 g durante 10 min a 4 °C. Luego, el sobrenadante se analizó mediante HPLC-MS/MS. Para inactivar por calor las proteínas utilizadas en los grupos de control, las proteínas se incubaron a 95 °C durante 20 min en glicerol al 50 % en PBS. Para la actividad de EPP in vitro, las proteínas se incubaron con 3D20E22P (equivalente a la cantidad encontrada en 18 pares de MAG, purificados por HPLC-MS/MS) en 100 µl de tampón (pH 7,5) que contenía Tris 25 mM, ácido acético 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM y DTT 1 mM a 27 °C durante 3 h. La reacción se terminó agregando 400 µl de metanol y se enfrió durante 1 h a -20 °C seguido de centrifugación a 20 000 g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se analizó por HPLC-MS/MS. Los fragmentos de PCR de EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) y EcK2 (556 pb) se amplificaron a partir de ADNc preparado a partir de cadáveres de mosquitos sin cabeza de sexo mixto. Se amplificó un fragmento de PCR del control eGFP (495 pb) a partir de pCR2.1-eGFP descrito previamente11; los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 2 de datos ampliados. Se insertaron fragmentos de PCR entre los promotores T7 invertidos en el plásmido pL4440. Las construcciones de plásmidos se recuperaron de E. coli competente NEB 5-alfa (New England Biolabs) y se verificaron mediante secuenciación de ADN antes de su uso (consulte los Datos complementarios 1 para las secuencias de inserción). Se usó un cebador que coincidía con el promotor T7 (Tabla 2 de datos ampliados) para amplificar insertos de plásmidos basados en pL4440. Los tamaños de los productos de PCR se confirmaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El dsRNA se transcribió a partir de las plantillas de PCR utilizando el kit de transcripción Megascript T7 (Thermo Fisher) y se purificó siguiendo las instrucciones del fabricante con las modificaciones descritas previamente35. Para la inyección de dsRNA, se inyectaron 1380 ng de dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) (Nanoject III, Drummond) a una concentración de 10 ng nl−1 en el tórax de machos o hembras adultos dentro de 1 día de la eclosión. Los niveles de eliminación de genes se determinaron en al menos tres réplicas biológicas mediante extracción de ARN, síntesis de ADNc y RT-qPCR. Para las inyecciones de ecdisteroides, dependiendo del diseño experimental, se inyectaron hembras vírgenes de 4 días o vírgenes de 6 días alimentadas con sangre (Nanoject III, Drummond) con 0.13, 0.21 o 0.63 µg de 20E o 3D20E a una concentración de 1,3, 2,1 o 6,3 ng nl−1, respectivamente. Se inyectó etanol al diez por ciento (vol/vol) en agua a un volumen de 100 nl; Se inyectó 3D20E22P en etanol al 10 % en un volumen de 100 nl (equivalente al 75 % de la cantidad encontrada en un par de MAG). Los mosquitos fueron asignados aleatoriamente a grupos de inyección. Para los ensayos de oviposición, las hembras de 3 días de edad fueron alimentadas con sangre ad libitum con sangre humana. Se eliminaron los mosquitos parcialmente alimentados o no alimentados. Dependiendo del tratamiento, después de un mínimo de 48 h después de la ingestión de sangre, las hembras se colocaron en recipientes de oviposición individuales durante cuatro noches. Los huevos se contaron bajo un estereoscopio (Stemi 508, Zeiss); para las hembras apareadas, los huevos que se convirtieron en larvas se calificaron como fértiles. Para los ensayos de apareamiento, dependiendo del tratamiento, a las hembras se les permitió un mínimo de 2 días para que desarrollaran refractariedad al apareamiento, y posteriormente se introdujeron en la misma jaula machos de la misma edad de tipo salvaje. Después de dos noches, se diseccionaron las espermatecas de las hembras y se liberó el ADN genómico mediante congelación-descongelación y sonicación en un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM y NaCl 25 mM (pH 8,2). Las muestras se incubaron con proteinasa K (0,86 µg µl−1) durante 15 min a 55 °C seguido de 10 min a 95 °C. La preparación de ADN genómico bruto se diluyó 10 veces y se sometió a detección por qPCR de una secuencia del cromosoma Y; los cebadores se enumeran en la Tabla 2 de datos ampliados. La ausencia de una secuencia del cromosoma Y es indicativa de que no hay apareamiento. Para los ensayos de reapareamiento, se controló la presencia de tapones de apareamiento en las hembras apareadas a la fuerza para confirmar el estado de apareamiento y se les permitió 2 días para que desarrollaran refractariedad al apareamiento en ausencia de machos, como se describió anteriormente36. Los machos portadores de esperma transgénico DsRed se introdujeron posteriormente en jaulas de hembras. Después de dos noches, se diseccionaron las espermatecas de las hembras y se preparó el ADN genómico como se describe anteriormente y se sometió a la detección por qPCR del transgén DsRed; los cebadores se enumeran en la Tabla 2 de datos ampliados. La ausencia del transgén DsRed indica que no se ha vuelto a aparear. 3D20E se sintetizó como se describió previamente37. En resumen, se disolvieron 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) en 10 ml de agua y luego se añadieron 30 mg de negro de platino (forma de polvo, Sigma-Aldrich). Se burbujeó continuamente una corriente suave de gas O2 en la mezcla de reacción, que se agitó a temperatura ambiente. Después de 6 h, la reacción se terminó agregando 30 ml de metanol. La mezcla se centrifugó y se eliminó el sedimento de catalizador. El sobrenadante se evaporó a sequedad al vacío a temperatura ambiente. El producto de reacción secado se disolvió en etanol al 10 % para inyección y metanol para análisis HPLC-MS/MS. La tasa de conversión (de 20E a 3D20E) fue de aproximadamente el 97% (Fig. 4b), y los espectros de MS del 3D20E sintetizado coincidieron con los del 3D20E encontrado en hembras apareadas (Fig. 4c). Las leyendas de las figuras contienen detalles específicos de las pruebas estadísticas realizadas. GraphPad (versión 9.0) se utilizó para realizar las pruebas exactas de Fisher, las pruebas de Mantel-Cox y las pruebas t de Student. Las pruebas de Cochran-Mantel-Haenszel se realizaron utilizando un script R personalizado (disponible en https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La normalidad de la distribución de datos se probó con la prueba de Shapiro-Wilk utilizando un umbral de significación de 0,05. Se realizaron pruebas de Mann-Whitney cuando los datos no pasaron la prueba de normalidad. Los datos de supervivencia se analizaron con la prueba de Mantel-Cox. El paquete DESeq2 (versión 1.28.1) se utilizó para realizar un análisis de expresión diferencial a nivel de genes de RNA-seq. Las barras horizontales en los gráficos representan medianas. Se utilizó un valor de significación de P = 0,05 como umbral en todas las pruebas. Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este documento. Todas las transferencias occidentales originales se proporcionan en la Información complementaria. Los datos del proteoma de MS se depositaron en ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) con el identificador de conjunto de datos PXD032157. Los conjuntos de datos de RNA-seq se depositaron en el repositorio Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con el registro de serie GSE198665. Otros conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento. De Loof, A. Ecdysteroids: ¿los esteroides sexuales de los insectos que se pasan por alto? Machos: la caja negra. ciencia de los insectos 13, 325–338 (2006). Artículo Google Académico Redfern, CPF 20-Hydroxy-ecdysone y desarrollo ovárico en Anopheles stephensi. J. Fisiol de insectos. 28, 97–109 (1982). Artículo CAS Google Académico Gabrieli, P. et al. 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Artículo CAS Google Académico Descargar referencias Damos las gracias a E. Nelson, K. Thornburg y E. Selland de ayuda con la cría de mosquitos y los miembros del laboratorio de Catteruccia para los comentarios sobre el manuscrito. El financiamiento para este estudio fue proporcionado por un premio conjunto de académicos académicos del Instituto Médico Howard Hughes y la Fundación Bill y Melinda Gates (BMGF) (ID de subvención OPP1158190) y por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (números de premio R01 AI104956 y R01 AI124165) para El trabajo de FC Proteomics fue apoyado por NIH (P41 GM103533) a MJM El trabajo de RNA-seq fue apoyado por Harvard Data Science Initiative (Postdoctoral Fellow Research Fund, 2019) a DP Los hallazgos y conclusiones dentro de esta publicación son responsabilidad de los autores y no reflejan necesariamente las posiciones o políticas del HHMI, la BMGF o los NIH. FC es un investigador del HHMI. Evdoxia G. Kakani y Sara N. Mitchell Dirección actual: Verily Life Sciences, South San Francisco, CA, EE. UU. Enzo Mameli Dirección actual: Departamento de Genética, Instituto Blavatnik, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU. Departamento de Inmunología y Enfermedades Infecciosas, Harvard TH Chan School of Public Health, Boston, MA, EE. UU. Dúo Peng, Evdoxia G. Kakani, Enzo Mameli, Sara N. Mitchell, Kelsey Adams, Tasneem A. Rinvee, W. Robert Shaw y Flaminia Catteruccia Centro de Harvard para espectrometría de masas, Cambridge, MA, EE. UU. Carlos Vidodez Departamento de Ciencias del Genoma, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU. Gennifer E. Merrihew y Michael J. MacCoss Instituto Médico Howard Hughes, Chevy Chase, MD, EE. UU. Flaminia Catteruccia También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar DP, EGK, SNM, WRS y FC concibieron el estudio, diseñaron experimentos e interpretaron los datos. DP, EGK, SNM, KA y TAR realizaron ensayos de apareamiento. CV llevó a cabo análisis de espectrometría de masas de ecdisteroides. EGK y SNM llevaron a cabo la recolección de muestras de RNA-seq y la preparación de bibliotecas. DP, EGK y SNM analizaron los datos de RNA-seq. DP construyó la canalización de bioinformática personalizada. EM llevó a cabo el etiquetado de isótopos de organismos completos y la recolección de muestras de proteomas. GEM y MJM llevaron a cabo análisis de espectrometría de masas de proteoma. DP realizó transferencias occidentales y coordinó la producción del anticuerpo personalizado. DP, EGK, SNM y TAR llevaron a cabo el silenciamiento de dsRNA, análisis de expresión génica RT-qPCR, ensayos de oviposición y ensayos de reapareamiento. DP y TAR llevaron a cabo ensayos de mortalidad. DP realizó síntesis química, expresó y purificó proteínas recombinantes y realizó ensayos enzimáticos. DP, WRS y FC escribieron el artículo. FC supervisó el estudio. Correspondencia a Flaminia Catteruccia. Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Nature agradece a Michael O'Connor y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles. Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales. 3D20E y 3D20E22P no se detectan en (a) hembras vírgenes alimentadas con sangre y (b, izquierda) hembras recién eclosionadas (dentro de 1 día de la eclosión), pero se detectan específicamente en (b, derecha) las glándulas accesorias (MAG) de recién eclosionadas. -machos encerrados. E, 20E y 20E22P se detectan en diferentes niveles en la mayoría de las muestras. En todos los paneles: Los datos se presentan como medias ± sem derivadas de tres repeticiones biológicas (pbm = post ingesta de sangre) Datos fuente ( a ) Representación esquemática de la reacción que se espera que sea catalizada por EPP transferido sexualmente en el atrio femenino apareado. La línea punteada resalta el resto de fosfato al que se dirige EPP. El EPP recombinante (rEPP) cataliza la desfosforilación de 3D20E22P in vitro. Usando 3D20E22P (extraído de los MAG por HPLC-MS/MS) como sustrato, se usó HPLC-MS/MS para detectar la producción de 3D20E después de la incubación con la enzima recombinante. DHFR: dihidrofolato reductasa, utilizada como control negativo; HI: rEPP inactivado por calor, utilizado como segundo control negativo. Los datos se presentan como medias ± sem que se derivaron de tres réplicas de ensayos in vitro. ( b ) Análisis del curso temporal de la expresión de EPP (rojo) y la actividad de la fosfatasa (púrpura) en los MAG en relación con dsGFP en el día 0 (medias ± sem). Los niveles de EPP fueron más bajos a los dos días posteriores a la inyección (dpi) y la actividad de fosfatasa fue más baja a los 3–4 dpi. Se agruparon los datos de tres réplicas. ( c ) Eficiencias de silenciamiento de RT-qPCR para inyecciones de dsRNA, normalizadas al gen ribosomal de limpieza RpL19, y calculadas como la expresión del gen objetivo en relación con el control GFP (medias ± sem). Se agruparon los datos de tres réplicas. Datos fuente Las inyecciones de 3D20E (0,63 µg) inducen una expresión significativamente más fuerte de MISO en comparación con la misma cantidad de 20E. Las inyecciones de 3D20E también activan de forma específica o más potente la expresión de la isoforma A de EcR (EcR-A) y los genes inducidos por el apareamiento AGAP006421, AGAP004263 y HPX15, mientras reprimen la isoforma EcR-B de EcR. Las inyecciones de 20E activan específicamente el gen de la proteína de la yema Vg y HR4, e inducen de forma más potente la expresión de HR3 (los datos se presentan como medias ± sem que se derivaron de tres réplicas biológicas de grupos de 10 mosquitos cada una (los datos de HR4 procedían de cuatro réplicas biológicas de grupos de 10 mosquitos cada uno), se realizaron pruebas t no pareadas, de dos caras, corregidas por FDR para comparaciones de 20E frente a 3D20E; la significación estadística encima de cada barra indica una comparación con la inyección de EtOH al 10 %: prueba t no pareada, de dos caras). Consulte la Tabla complementaria 3 para conocer los valores de P Datos fuente (a) La supervivencia de los machos se ve afectada negativamente por el silenciamiento de EcK1 y EcK2 pero no de EPP. La tasa de supervivencia se reduce significativamente en machos silenciados con EcK1 (izquierda) y machos silenciados con Eck2 (centro), pero no en machos silenciados con EPP (derecha) en relación con los controles dsGFP (media ± sem, n indica el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes , prueba de Mantel-Cox, bilateral). ( b - c ) EcK2 recombinante (rEcK2) fosforila de manera eficiente (b) 20E pero no (c) 3D20E, según lo determinado por HPLC-MS / MS. Las medias ± sem se derivaron de tres réplicas de ensayos in vitro. Los controles negativos (DHFR e inactivados por calor, HI, rEcK2) no fosforilan 20E o 3D20E. Se proporcionan representaciones esquemáticas de las reacciones catalizadas por EcK2. Datos fuente (a) La expresión de EcK2 es alta en el tracto reproductivo inferior (LRT) de las hembras vírgenes y se suprime después del apareamiento. La alimentación con sangre no afecta la expresión de EcK2 en diferentes momentos posteriores a la ingesta de sangre (pbm) (0 h: P = 0,024, 3 h: P = 0,031, 24 h: P = 0,029, media ± sem, prueba t no pareada, lado). (b) 20E22P se detecta en el LRT de hembras vírgenes después de una comida de sangre (media ± sem). La cuantificación se realizó mediante HPLC-MS/MS. Las líneas punteadas conectan los valores medios del mismo ecdiesteroide en diferentes momentos. ( c ) El silenciamiento de EcK2 antes de la alimentación con sangre aumenta significativamente la proporción de 20E frente a 20E22P a 26 pbm en la LRT de hembras vírgenes (P = 0.047, media ± sem, prueba t no apareada, unilateral). (d) La receptividad de apareamiento (evaluada por la presencia de un tapón de apareamiento) en hembras vírgenes alimentadas con sangre no se ve afectada por el silenciamiento de EcK2 (P = 0,50, prueba exacta de Fisher, bilateral, datos agrupados de dos réplicas). ( e ) La receptividad de apareamiento no se ve afectada en las vírgenes por el silenciamiento de EcK2 (P = 0.98, prueba de Cochran-Mantel-Haenszel, bilateral). (f) La oviposición es altamente inducida en vírgenes cuando EcK2 se silencia antes de la alimentación con sangre (arriba) (P = 3.30e-06, prueba de Cochran-Mantel-Haenszel, bilateral, los datos fueron de cuatro repeticiones), pero no cuando esto la cinasa se silencia después de la alimentación con sangre (abajo) (P = 0,94, prueba de Cochran-Mantel-Haenszel, bilateral). (g) La expresión de EcK2 no se suprime mediante la inyección de 20E o 3D20E en relación con los controles inyectados con EtOH al 10 %. Los valores de expresión se normalizaron al gen de limpieza RpL19 en las muestras respectivas antes de calcular los cambios de pliegue (medias ± sem, pruebas t no pareadas, bilateral, 20E: P = 0,46, 3D20E: P = 0,85). En todos los paneles: n indica el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes, ns = no significativo. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,001. Los datos procedían de tres réplicas biológicas en todos los paneles, a menos que se indique lo contrario Datos fuente Imágenes sin recortar utilizadas para generar la Fig. 2d. Lista de proteínas transferidas de los machos a la aurícula de la hembra durante la cópula (ejaculoma). Ver Fig. 2c y Métodos para más detalles. La abundancia de proteínas se muestra como NSAF en dos réplicas en tres puntos de tiempo. Lista de proteínas detectadas en los MAG por MS. La abundancia de proteínas se muestra como NSAF en tres repeticiones. Secuencias de construcciones de dsRNA (secuencias específicas del gen diana). Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Reimpresiones y permisos Peng, D., Kakani, EG, Mameli, E. et al. Un esteroide masculino controla el comportamiento sexual femenino en el mosquito de la malaria. Naturaleza 608, 93–97 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6 Descargar cita Recibido: 24 enero 2022 Aceptado: 25 de mayo de 2022 Publicado: 06 julio 2022 Fecha de emisión: 04 de agosto de 2022 DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6 Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido: Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo. Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt Genómica BMC (2022) Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.