Efecto de la terapia hormonal sobre los cambios otoconiales causados por la deficiencia de estrógenos

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22596 (2022) Citar este artículo

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El vértigo posicional paroxístico benigno (VPPB) se asocia con la menopausia y/o la osteopenia. Se han informado cambios morfológicos en la capa otoconial después de la ovariectomía (OVX). Además, la terapia de reemplazo hormonal disminuye el riesgo de VPPB. Sin embargo, el conocimiento sobre el efecto de la terapia hormonal en los cambios otoconiales causados por la deficiencia de estrógenos es limitado. Nuestro objetivo fue examinar el efecto de la terapia hormonal sobre los cambios otoconiales causados por la deficiencia de estrógenos. Presumimos que la terapia hormonal podría reducir los cambios otoconiales causados por OVX. Los ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad se dividieron en cuatro grupos: operación simulada con implantación de vehículo (simulada + v), OVX con implantación de vehículo (OVX + v), OVX con implantación de estradiol (E2) (OVX + E2 ), y OVX con implantación de grupos raloxifeno (RAL) (OVX + RAL). El volumen de la capa otoconial se midió mediante micro-CT a las 4 semanas después de la OVX o la operación simulada. Se extirparon las ampollas óticas; Se realizó inmunohistoquímica para receptor de estrógenos alfa y 4-hidroxinonenal. El volumen de la capa otoconial fue significativamente mayor en el grupo OVX + v que en el grupo sham + v. E2 y RAL redujeron significativamente estos cambios en la capa endometrial. La tinción del receptor de estrógeno alfa y 4-hidroxinonenal fue más fuerte en el grupo OVX + v que en el grupo simulado + v, pero igual en los grupos simulado + v, OVX + E2 y OVX + RAL. Estos resultados indican que E2 y RAL son efectivos contra los cambios morfológicos de la capa otoconial causados por la deficiencia de estrógenos a través de la reducción del estrés oxidativo.

El vértigo posicional paroxístico benigno (VPPB) es un trastorno vestibular común. Un ataque típico de VPPB se desencadena por un movimiento horizontal o vertical de la cabeza. Varios pacientes afirman que se produce un ataque de vértigo grave al acostarse, darse la vuelta o sentarse en la cama. La incidencia acumulada de VPPB a lo largo de la vida es de casi el 10% a los 80 años1. La etiología ampliamente aceptada del VPPB es que los desechos otoconiales desalojados del utrículo flotan hacia la endolinfa y quedan atrapados en el canal semicircular. El cambio en la posición de la cabeza da como resultado el movimiento de los desechos otoconiales por gravedad y sigue un flujo de endolinfa anormal, lo que lleva a una señal de cúpula inapropiada, que finalmente da lugar a un ataque de vértigo. El curso natural del VPPB sin terapia de reposicionamiento del canal da como resultado una remisión espontánea durante varias semanas2. El procedimiento de reposicionamiento de canalitos a menudo se realiza para pacientes con VPPB. Se ha informado que la tasa de curación del procedimiento de reposicionamiento de canalitos es más alta (94,2 %) en comparación con la de ningún tratamiento (36,4 %), y la tasa de recaída es del 3,8 % dentro de los 6 meses3. A pesar de su efecto a corto plazo, se ha informado que el 33,8-50% de los pacientes con VPPB tienen una recurrencia dentro de varios años4,5,6,7 y el VPPB empeora la calidad de vida de los pacientes8. Sin embargo, no existe un tratamiento estándar para el VPPB.

Según estudios previos, el VPPB es más común en mujeres de mediana edad9, y la terapia de reemplazo hormonal disminuye su riesgo10. Además, se ha informado que los pacientes con VPPB tienden a tener una densidad mineral ósea baja y concentraciones séricas bajas de vitamina D6,11,12,13,14,15,16, y aquellos que tienen recurrencia tenían un nivel más bajo de vitamina D que el grupo de no recurrencia6,12,15,17. Estos estudios sugieren que el VPPB está relacionado con condiciones posmenopáusicas o alteraciones del metabolismo óseo. En estudios previos en animales, la ovariectomía bilateral (OVX), que induce deficiencia de estrógenos y osteoporosis, provocó cambios morfológicos en la otoconia18,19,20. También se ha informado que la suplementación con fitoestrógenos previene los cambios otoconiales inducidos por OVX18. Se ha demostrado que el estrógeno tiene propiedades antioxidantes21, mientras que otros estudios han informado que el VPPB está asociado con el estrés oxidativo22,23,24. Sin embargo, ningún estudio ha investigado el efecto de los estrógenos o los medicamentos para la osteoporosis sobre los cambios en la otoconia debido a la deficiencia de estrógenos, así como la relación entre la deficiencia de estrógenos y el estrés oxidativo en el utrículo. Por lo tanto, nuestro objetivo fue examinar este tema en este estudio.

El estrógeno es una hormona esteroide y actúa como factor de transcripción a través del receptor de estrógeno (ER), que es uno de los receptores nucleares25. La administración de estrógenos se aplica a los síntomas climatéricos26. Sin embargo, la administración de estrógenos para el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica es controvertida27,28,29. Para dicho tratamiento, se proporciona ampliamente la administración de raloxifeno (RAL). RAL es un modulador selectivo de ER (SERM). Además, es un agente no esteroideo que se une a ER27. Su acción como agonista o antagonista varía según el tejido del órgano30. Sin embargo, se desconoce si RAL actúa como agonista o antagonista en el oído interno. Para examinar este tema, en este estudio, elegimos RAL para el tratamiento de la osteoporosis. Nuestra hipótesis fue que los medicamentos con estrógenos u osteoporosis podrían prevenir los cambios otoconiales causados por la deficiencia de estrógenos mediante la reducción del estrés oxidativo. Este estudio puede proporcionar información útil sobre las opciones de tratamiento para prevenir la aparición de VPPB.

La Figura 1 muestra las mediciones del peso uterino para cada grupo a las 4 semanas después de la operación. Los pesos uterinos fueron 86,4 ± 39,4 mg, 12,0 ± 3,0 mg, 217,7 ± 30,1 mg y 25,8 ± 4,4 mg, en el sham + vehículo (sham + v), OVX + vehículo (OVX + v), OVX + Estradiol (OVX + E2) y OVX + Raloxifeno (OVX + RAL), respectivamente. El peso uterino en el grupo OVX + v fue significativamente menor que en el grupo sham + v (p < 0,001). El peso uterino en el grupo OVX + E2 fue significativamente mayor que en los grupos OVX + v (p < 0,001) y OVX + RAL (p < 0,001). Estos datos mostraron que la OVX se realizó correctamente, el ratón absorbió el sedimento de estradiol y el sedimento de raloxifeno no afectó fuertemente al útero.

Peso del útero (cada n = 9-15). El peso del útero disminuyó después de la ovariectomía (OVX). La administración de estradiol (E2) aumentó significativamente el peso del útero en relación con OVX con vehículo (p < 0,001). El peso del útero fue significativamente mayor en el grupo OVX + raloxifeno (RAL) que en el grupo OVX + v (p = 0,002). (ANOVA: p < 0,001, *: p < 0,01).

La Figura 2 muestra las densidades minerales óseas (DMO) totales de los fémures en cada grupo a las 4 semanas después de la operación. Las DMO femorales fueron 28,8 ± 1,0 mg/cm3, 27,3 ± 0,7 mg/cm3, 36,7 ± 1,0 mg/cm3 y 31,2 ± 1,2 mg/cm3 para el tratamiento simulado + v, OVX + v, OVX + E2 y OVX + RAL grupos, respectivamente. La DMO fue significativamente menor en el grupo OVX + v que en el grupo sham + v (p < 0,001). Las DMO fueron significativamente más altas en los grupos OVX + E2 y OVX + RAL que en el grupo OVX + v (ambos p < 0,001). Estos datos demostraron que las administraciones de estradiol y raloxifeno fueron efectivas para el metabolismo óseo.

Las densidades minerales óseas (DMO) de los fémures medidas por DEXA (cada n = 9–25). La DMO de los fémures fue significativamente menor en el grupo OVX + v que en el grupo sham + v (p < 0,001). La administración de estradiol o raloxifeno aumentó significativamente la DMO de los fémures en relación con los del grupo OVX + v (p < 0,001 y p < 0,001, respectivamente). (ANOVA: p < 0,001, *: p < 0,01).

La Figura 3 muestra el volumen de la capa otoconial del utrículo obtenido por micro-CT (µCT) para cada grupo a las 4 semanas del postoperatorio. Los volúmenes de la capa otoconial del utrículo fueron 481.272,0 ± 19.998,2 µm2, 511.274,3 ± 20.755,1 µm2, 472.776,9 ± 29.765,6 µm2 y 483.702,3 ± 21.973,8 µm2 para el sham + v, OVX + v, grupos OVX + E2 y OVX + RAL, respectivamente. El volumen de la capa otoconial del utrículo fue significativamente mayor en el grupo OVX + v que en el grupo sham + v (p < 0,001), mientras que no fue significativamente diferente en los grupos sham + v, OVX + E2 y OVX + RAL .

El volumen de la capa otoconial del utrículo se midió mediante una exploración micro-CT (cada n = 10-26). El volumen de la capa otoconial del utrículo en el grupo OVX + v fue significativamente mayor que en el grupo sham + v (p < 0,001). Los volúmenes de las capas otoconiales del utrículo en los grupos OVX + E2 y OVX + RAL fueron significativamente más bajos que los del grupo OVX + v (p = 0,007 y p = 0,04, respectivamente) (ANOVA: p < 0,001, *: p < 0,01, **: p < 0,05).

Se realizó un análisis de expresión diferencial del ARNm total en el utrículo. Tras obtener los resultados del volumen de la capa otoconial, se compararon los datos del grupo OVX+v con los de los grupos sham+v, OVX+E2, OVX+RAL. En comparación entre los grupos OVX + E2 y OVX + v, la expresión de Gstp2 en el grupo OVX + E2 fue significativamente mayor, y las expresiones de Orc8, Amd2, Mettl16, Slc35b1, Cog5, Wdr41, Sra1 y Stard8 en el OVX + grupo E2 fueron significativamente más bajos. En comparación entre los grupos OVX + RAL y OVX + v y entre los grupos sham + vy OVX + v, se encontró que la expresión del gen Gstp2 era significativamente mayor en los grupos OVX + RAL y sham + v. Como se mencionó anteriormente, la expresión del gen Gstp2 fue significativamente menor en el grupo OVX + v que en los otros grupos (Figs. 4 y 5). Gstp2 codifica la glutatión S-transferasa (GST) pi2. GST pi2 (GSTP) es una enzima de desintoxicación de fase II que puede desintoxicar especies reactivas de oxígeno o compuestos tóxicos endógenos y exógenos31.

El diagrama de Venn para la expresión de ARNm en el utrículo de ratones. El diagrama de Venn para la diferencia de expresión de ARNm en el utrículo de los grupos simulado + vehículo, OVX + estradiol y OVX + RAL en comparación con el grupo OVX + vehículo bajo una tasa de descubrimiento falso de 0,05 (cada n = 5). Solo la expresión de Gstp2 disminuyó significativamente en el grupo de vehículo OVX + en comparación con los de los otros grupos.

La expresión de Gstp2 en el utrículo (cada n = 5). La expresión de Gstp2 en el grupo de OVX + vehículo fue significativamente más baja que en otros grupos (tasa de descubrimiento falso [FDR]-p < 0,001 frente al grupo simulado + vehículo; FDR-p = 0,02 frente al grupo de OVX + estradiol; FDR- p = 0,003 vs. grupo OVX + raloxifeno).

Se observó una mayor intensidad de ER alfa (ERα) en el utrículo para el grupo OVX + v que para el grupo sham + v, y el tratamiento con estradiol o raloxifeno la redujo al nivel observado para el grupo sham + v (Fig. 6). Además, la intensidad de 4-hidroxinonenal (4-HNE) fue notablemente mayor en el grupo OVX + V que en los otros grupos. En especial, la 4-HNE es un metabolito de la peroxidación lipídica y se sabe que es un marcador de estrés oxidativo32.

La inmunohistoquímica del utrículo. La tinción tanto del receptor de estrógeno alfa (ERα) como del 4-hidroxinonenal (4-HNE) fue notablemente más fuerte en el grupo de vehículo OVX + que en el grupo de vehículo simulado +. La tinción de ERα y 4-HNE en los grupos OVX + estradiol y OVX + raloxifeno fue inferior a la del grupo OVX + vehículo e igual a la del grupo simulado + vehículo.

En este estudio, el volumen de la capa otoconial del utrículo aumentó significativamente con OVX, lo que provocó una deficiencia de estrógenos. La administración de E2 o RAL impidió estos cambios morfológicos en la capa otoconial provocados por OVX. El análisis de RNA-seq reveló que la expresión de Gstp2, que codifica GSTP, disminuyó significativamente en el grupo OVX + v. El análisis inmunohistoquímico mostró que las expresiones de ERα y 4-HNE fueron mayores en el grupo OVX + v que en los otros grupos. Estos resultados sugieren que la administración de E2 o RAL fue efectiva para reducir los cambios morfológicos en la capa otoconial del utrículo causados por la deficiencia de estrógeno al suprimir el estrés oxidativo a través de los RE.

Un trabajo anterior informó que OVX indujo otoconias19 grandes y sueltas, así como un mayor volumen de capa otoconial en el utrículo20. Nuestros hallazgos del grupo OVX + v respaldan los de los informes antes mencionados. Es de destacar que E2 y RAL suprimen estos cambios de capa otoconial debido a OVX. Aunque nuestros datos mostraron el cambio de expresión de ERα, no medimos ERß ya que el estudio anterior mostró que el estrógeno regulaba la expresión de ERα mientras que ERß se mantuvo estable en el oído interno33. Sin embargo, se desconoce cómo funcionan ERα y ERß para mantener la estructura del utrículo. Se requieren más estudios para investigar la asociación de la deficiencia de estrógenos con ERα o ERβ.

El análisis de RNA-seq reveló que la expresión de Gstp2 fue significativamente menor en el grupo OVX+v que en los otros grupos (Figs. 4 y 5). Gstp2 GSTP, miembro de la familia GST. Las GST son enzimas de fase II que detoxifican xenobióticos endógenos o exógenos para proteger las células31. Las GST catalizan la conjugación de electrófilos y causan disfunción celular con glutatión. Los conjugados de glutatión generados se eliminan extracelularmente a través de un transportador, que es una proteína resistente a múltiples fármacos que protege a las células del daño34,35. Además de esta desintoxicación, se ha informado recientemente que GSTP regula las vías de señalización de las quinasas de estrés36,37,38. La quinasa jun-terminal (JNK) es una quinasa de estrés representativa que se desencadena por el estrés, como el estrés oxidativo, el shock cerebral y las citoquinas inflamatorias39,40,41. GSTP forma un complejo con JNK conservando la actividad básica de JNK. El estrés oxidativo, las citocinas o los fármacos provocan la descomposición del complejo GSTP-JUN y la activación de la señalización de JNK, lo que da lugar a la apoptosis o proliferación36,39,42. Muthusami et al. informó que OVX induce el deterioro del sistema antioxidante, incluido GST43. Nuestros resultados sugieren que la deficiencia de estrógenos disminuye la expresión de GSTP, lo que conduce a la acumulación intracelular de componentes oxidativos.

La intensidad de tinción de 4-HNE y ERα en el utrículo fue más fuerte en el OVX + v que en los otros grupos (Fig. 5). La fuerte intensidad de ERα en el grupo OVX + v puede representar una retroalimentación de la deficiencia de estrógeno. En especial, la 4-HNE es un metabolito de la peroxidación lipídica y un conocido marcador de estrés oxidativo32. Estudios previos han demostrado que la menopausia induce un aumento del estrés oxidativo y disminuye la actividad antioxidante43,44,45,46,47,48,49. Además, se ha informado que la terapia de reemplazo hormonal44,45,46,47 o la suplementación con agentes antioxidantes48 previenen los efectos adversos de OVX. También se ha informado que el estrógeno tiene propiedades antioxidantes independientes del RE21,50,51. Estos estudios han revelado una fuerte relación entre el estrógeno y el estrés oxidativo. Algunos estudios clínicos recientes también han demostrado que el VPPB está asociado con el estrés oxidativo22,23,24. Con base en lo mencionado anteriormente, se sugiere que el control del estrés oxidativo puede ser un enfoque novedoso para el VPPB, particularmente para pacientes perimenopáusicas.

En este estudio, E2 y RAL fueron efectivos para la supresión de cambios morfológicos en la capa otoconial. RAL, que es uno de los SERM, evita efectos innecesarios sobre el RE en la glándula mamaria o el útero30. Por lo tanto, RAL se usa con frecuencia para tratar la osteoporosis menopáusica27,52. RAL actúa sobre el RE en los huesos como agonista y en las glándulas mamarias o el útero como antagonista49. Esto puede suprimir el riesgo de tumores inducidos por estrógenos30. Se ha informado que el mecanismo de esta acción única de SERM podría explicarse por la expresión diferencial de ER, la conformación diferencial de ER en la unión del ligando y la expresión y unión diferencial de proteínas correguladoras en células diana53. Se ha demostrado que la RE existe ampliamente en el oído interno54. Sin embargo, se desconoce su acción sobre el RE en el oído interno. En este estudio, similar a E2, RAL previno los cambios morfológicos en la capa otoconial causados por OVX. Además, los resultados de inmunohistoquímica mostraron que la intensidad de OVX + E2 era casi la misma que la de OVX + RAL en el utrículo. Sin embargo, se desconoce si RAL actúa directamente sobre el oído interno. Existe la posibilidad de que la mejora en el metabolismo óseo por la administración de RAL pueda aliviar indirectamente los cambios en la capa otoconial causados por la deficiencia de estrógenos. Se ha informado que el metabolismo óseo está relacionado con el metabolismo de la glucosa, la linfopoyesis y el metabolismo de las grasas a través de osteocitos u osteoblastos55,56. Algunos factores secretados por los osteocitos o los osteoblastos también pueden regular el metabolismo de los otolitos. Se necesitan más estudios para identificar si los SERM afectan directa o indirectamente al oído interno.

Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, dado que los ratones no son genéticamente monoclonales como las células cultivadas, puede haber genes falsos negativos durante el análisis de ARN. Además, no se realizó un ensayo de PCR en tiempo real para validar la expresión génica alterada. En segundo lugar, no está claro cómo el estrés oxidativo cambia morfológicamente la otoconia. Se ha demostrado que las otoconias están compuestas principalmente por proteínas constituyentes, proteínas de anclaje y proteínas reguladoras57. El estrés oxidativo también puede afectar la expresión de estas proteínas. Se requieren más estudios para identificar el mecanismo molecular que subyace al efecto del estrés oxidativo en la estructura otoconial o el entorno vestibular. En tercer lugar, evaluamos el volumen de la capa otoconial del utrículo usando solo µCT y no realizamos otras técnicas, incluida la histopatología o la microscopía electrónica de barrido (SEM). Anteriormente informamos que el volumen de la capa otoconial medido con µCT se asoció significativamente con los resultados del estudio histopatológico20. Por lo tanto, los resultados de µCT se consideraron fiables. Sin embargo, como el tamaño de vóxel en el µCT era de 6 µm, se necesitaba SEM para observaciones detalladas. Cuarto, este estudio no consideró el ciclo estral. Los ratones tienen un ciclo estral de 4 a 5 días58. Sin embargo, no se ha informado si el ciclo estral influye en el sistema vestibular. Se requieren estudios futuros para confirmar si el ciclo estral influye en la estructura otoconial. Además, no medimos E2 en suero ya que el costo de la medición de E2 es alto. En cambio, determinamos la deficiencia de E2 indirectamente midiendo el peso del útero y la DMO. Como tanto el peso uterino como la DMO disminuyeron significativamente por OVX en este estudio, se pensó que los ratones OVX estaban privados de E2. Sin embargo, se necesitan más estudios para incluir la medición de E2. Finalmente, la dosis de E2 y RAL administrada por pellet fue superior a la dosis utilizada clínicamente59,60. En este estudio, se usaron gránulos para administrar E2 o RAL para prevenir el estrés de los animales. Sin embargo, se necesitan más estudios para investigar si las dosis más bajas de estos medicamentos son efectivas para prevenir los cambios morfológicos de la capa otoconial debido a OVX.

En conclusión, la deficiencia de estrógenos provocó cambios morfológicos en la capa otoconial del utrículo, y la administración de E2 o RAL previno estos cambios en la capa otoconial. El mecanismo subyacente a los efectos de E2 o RAL sigue siendo desconocido. Sin embargo, los resultados de este estudio sugieren que E2 y RAL reducen el estrés oxidativo. Se necesitan más trabajos para investigar si E2 o RAL reducen el estrés oxidativo a través de ER.

El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética para Experimentos con Animales de la Universidad de Ehime (No. 05HI77-1). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes. Este estudio se realizó de acuerdo con las pautas ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Se compraron ratones hembra C57BL/6 J de Japan SLC (Shizuoka, Japón) y se dividieron aleatoriamente en los siguientes cuatro grupos: (1) operados de forma simulada con gránulos de vehículo (grupo simulado + v), (2) OVX con gránulos de vehículo (OVX + v), (3) OVX con gránulos que liberan 17beta-estradiol (OVX + grupo E2) y (4) OVX con gránulos que liberan raloxifeno (RAL), que es un SERM (OVX + grupo RAL). Los ratones fueron operados de forma simulada u ovariectomizados a las 8 semanas de edad bajo anestesia usando inyecciones intraperitoneales de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) y butorfanol (5 mg/kg). En el procedimiento de OVX, hicimos una incisión en la piel en la parte baja de la espalda e identificamos el peritoneo. Luego, realizamos la disección del peritoneo, extirpamos el ovario y finalmente suturamos la incisión. En ratones con operación simulada, los ovarios se identificaron y no se extirparon, y los gránulos del vehículo se implantaron por vía subcutánea inmediatamente después de la OVX. En los ratones OVX, se implantaron por vía subcutánea los siguientes gránulos: gránulo de vehículo, gránulo de estradiol de liberación lenta (50 µg/60 días) o gránulo de raloxifeno de liberación lenta (2,4 mg/60 días) (Innovative Research of America, Sarasota, FL). , EE.UU). Después de la operación OVX o simulada, los ratones se devolvieron a sus jaulas hasta que se realizaron más pruebas. Todos los ratones se mantuvieron en el mismo ambiente a una temperatura de 21-23 °C y con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h (luces de 7:00 a. m. a 7:00 p. m.), y tenían libre acceso a la comida estándar. y agua, ad libitum, en el animalario de la Universidad de Ehime.

Los ratones fueron sacrificados a las 4 semanas después de la operación OVX o simulada, considerando los resultados de un estudio previo, en el que el volumen de la capa otoconial aumentó significativamente a las 4 semanas después de OVX20. Fueron anestesiados profundamente con ketamina (200 mg/kg) y xilazina (20 mg/kg) y sacrificados. Las ampollas óticas se retiraron y se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h, se descalcificaron con EDTA 0,1 M durante 4 días y se incluyeron en parafina. La DMO total de los fémures se midió mediante absorciometría de rayos X de energía dual con un analizador de minerales óseos (DCS-600EX, Aloka, Tokio, Japón). Se midió el peso uterino para examinar los efectos de la OVX y la medicación.

El volumen de la capa otoconial se evaluó mediante µCT (Scanco Medical, Brüttisellen, Suiza). Anteriormente informamos que el volumen de la capa otoconial obtenido a partir de imágenes de escaneo µCT se correlacionó con el obtenido en un estudio histológico20. Después de sacrificar a los ratones bajo anestesia profunda, se extrajeron las ampollas óticas y se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h. Las ampollas óticas se fijaron posteriormente con etanol al 70 % durante 24 h y se realizó una exploración µCT con un sistema Scanco Medical µCT35 con un tamaño de vóxel isotrópico de 6 µm. Los escaneos se realizaron con un tubo de rayos X con un potencial de 70 kVp y una intensidad de 114 µA, y las imágenes de la capa otoconial del utrículo se analizaron con el software ImageJ (US National Institute of Health, Bethesda, ML, EE. UU.) (Fig. 7 ). Después de la binarización, se determinó la estructura membranosa de la otoconia del utrículo. Se compararon las áreas totales de la estructura membranosa del utrículo de todos los cortes para los cuatro grupos.

La imagen micro-CT del utrículo. (a) La imagen original de la capa otoconial del utrículo (flecha blanca) se obtuvo de una exploración por micro-CT. (b) La imagen binarizada de la capa otoconial utilizando el software Image J. Después de la binarización, el volumen de la capa otoconial del utrículo se calculó utilizando el software image J.

Después de la decapitación, se extrajeron las ampollas óticas. La ventana oval se fenestraba cuidadosamente bajo el agua y se diseccionaba el utrículo. El utrículo se estabilizó rápidamente usando el reactivo de tejido RNAprotect (#76,104, Qiagen, Hilden, Alemania) y se almacenó a 4 °C hasta la extracción del ARN. El ARN total se extrajo del utrículo utilizando el kit NucleoSpin RNA XS (# 74,902.50, Macherey-Nagel, Waltham, MA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se verificó con un bioanalizador Agilent 2100 (#G2939A, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. tecnologías). El ARN total de alta calidad, que mostró más de 7 números de integridad de ARN (RIN), se utilizó para análisis posteriores (promedio, 7,96; 7,30–8,24). La biblioteca de RNA-Seq se construyó a partir de 1 ng de RNA total utilizando el QuantSeq 3'mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina (FWD) (n.º 015.384, LEXOGEN, Viena, Austria). La biblioteca construida se secuenció con NextSeq500 (Illumina) con NextSeq 5050/550 High Output Kit v2.5 (75 ciclos) (n.º 20 024 906, Illumina) en el Instituto de Investigación de ADN Kazusa (Chiba, Japón). Los datos de la secuencia se analizaron usando el CLC Genomics Workbench (Qiagen). Brevemente, el fastq se recortó según las pautas del kit de construcción de la biblioteca. Especialmente, se eliminaron las secuencias adaptadoras y poliA y los nucleótidos de baja calidad en el extremo 3'. Se realizó el recorte de los primeros 12 nucleótidos en el extremo 5' y se eliminaron del conjunto de datos las lecturas de longitud corta por debajo de 20 nucleótidos. El fastq recortado se asignó a la secuencia de referencia Mus musculus (GRCm39.105) utilizando la configuración predeterminada. El análisis de expresión diferencial se realizó mediante el método de normalización CPM.

Después de la inclusión en parafina, secciones de las sectas de ampollas óticas. (4 µm) fueron preparados. Posteriormente fueron desparafinados y rehidratados. La recuperación del antígeno se realizó en tampón de ácido citracónico (Immunosaver®, #097–06,192, Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation) durante 45 min en un autoclave a 95 ℃. La actividad de la peroxidasa endógena se inhibió con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 15 min y las secciones se bloquearon con RTU Animal Free Blocker and Diluent® (SP-5035, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Después de enjuagar con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las secciones se incubaron con anticuerpos policlonales de conejo contra ERα (1:200, n.° 106,132-T08, Sino Biological) y 4-HNE (1:400, n.° bs-6313R, Bioss) durante la noche. a 4℃. Después de enjuagar nuevamente con PBS, se incubaron con un anticuerpo secundario (Histofine Simple Stain Mouse MAX-PO(R) #414,341, Nichirei Biosciences, Tokio, Japón) durante 1 h a temperatura ambiente y se tiñeron con el cromógeno DAB durante 10 mín. Después de un enjuague final, se realizó una contratinción con hematoxilina de Mayer.

Los resultados se expresan como medias ± desviaciones estándar. Los datos de los grupos se compararon mediante ANOVA y la prueba de Steel-Dwass con JMP para Macintosh (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). La significación estadística se fijó en p < 0,05. Para el análisis de expresión diferencial de ARNm, los datos del grupo OVX + v se compararon con los de los grupos sham + v, OVX + E2 y OVX + RAL utilizando la prueba t con CLC Genomics Workbench (Qiagen). Los valores de p de FDP < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio GEO, GSE216449 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE216449).

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Takahiro Nakata

División de Fisiopatología Integrativa, Proteo-Science Center, Universidad de Ehime, Toon, Japón

Aoi Ikedo y Yuuki Imai

División de Apoyo a la Investigación Médica del Centro de Apoyo a la Investigación Avanzada, Universidad de Ehime, Toon, Japón

Naohito Tokunaga

Departamento de Fisiopatología, Facultad de Medicina de la Universidad de Ehime, Toon, Japón

yuuki imai

División de Investigación en Animales de Laboratorio, Centro de Apoyo a la Investigación Avanzada, Universidad de Ehime, Toon, Japón

yuuki imai

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TN, MO, NH y YI concibieron el estudio y escribieron el manuscrito. EN, SA y TT participaron en la recopilación de datos. AI, NT y YI participaron en la recopilación, el análisis y la interpretación de los datos.

Correspondencia a Takahiro Nakata.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Nakata, T., Okada, M., Nishihara, E. et al. Efecto de la terapia hormonal sobre los cambios otoconiales causados por la deficiencia de estrógenos. Informe científico 12, 22596 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-27240-5

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Recibido: 18 Octubre 2022

Aceptado: 28 de diciembre de 2022

Publicado: 30 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-27240-5

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